美洛昔康对荷瘤BALB/c小鼠的围手术期镇痛效果

刘师佳 高硕磊 覃尧 张红

（海南大学动物科技学院，海口 570228）

摘要：目的 为了降低肿瘤切除术过程中小鼠的围术期疼痛，保障动物福利最大化和研究数据的准确性，本研究探究美洛昔康对荷瘤小鼠的围术期镇痛作用。方法 所有BALB/c小鼠均采用舒泰和右美托嘧啶的麻醉方案，分为对照组（A组）和美洛昔康注射组（B组）。采用面部表情评分系统和疼痛行为频率评估小鼠的疼痛程度；监测小鼠的体质量以及脏器的组织病理学方法评估围手术期安全性。结果 B组小鼠的麻醉诱导时间较A组缩短，苏醒时间较A组明显延长（P<0.01）;术后3d内，B组小鼠的面部表情评分和疼痛行为频率较A组显著降低；两组小鼠的主要脏器和肠道组织在组织病理学上均无明显病变，体质量无显著差异，B组小鼠全部存活。结论 舒泰和右美托嘧啶麻醉方案联合美洛昔康可以缩短BALB/c小鼠的麻醉诱导时间并使其缓慢苏醒，显著地降低了小鼠围手术期的疼痛，且是安全的。

关键词：BALB/c小鼠;围手术期；阵痛，美洛昔康；动物福利

中图分类号：Q95-3  文献标识码:A 

文献编号：1006-6179（2024）02-0028-07

DOI:10.3969/j.issn.1006-6179.2024.02.005

生物医学实验中常选择实验小鼠作为研究对象，其在生理生化、代谢通路及调控机制方面与人类相似，由其获得的研究成果为人类医学提供大量的参考数据^[1]。肿瘤术后复发和转移是亟待解决的临床难题，大量研究工作者仍不懈努力地探究新型疗法解决该问题。这个问题中往往需要开展大量的临床前研究，需要建立荷瘤小鼠术后复发和转移模型，涉及小鼠的麻醉和肿瘤切除术。肿瘤切除术必然会产生围手术期的疼痛，这会造成两方面的影响：（1）小鼠的痛苦不符合动物福利要求；（2）改变小鼠的一系列生理和免疫过程，可能会影响研究结果的准确性^[2]。因此，在荷瘤小鼠术后复发和转移模型中我们需要评估小鼠并尽可能减轻其疼痛，这既可实现实验动物福利伦理，也能保障实验数据的准确性。

本研究选用舒泰（Zoletil）和右美托嘧啶(Dexmedetomidine)作为小鼠麻醉用药。舒泰是一种新型的注射用麻醉剂，含有分离型麻醉剂成分替来他明（Tiletamine），以及有镇定和肌肉松弛效果的唑拉西泮(Zolazepam)^[3]。在全身麻醉时唑拉西泮可以加强替来他明对中枢神经系统的抑制作用，还可以防止替来他明可能引起的机体惊厥，增加肌肉松弛的效果^[4]。舒泰是安全的兽类麻醉剂，被广泛应用于宠物及野生动物的麻醉，如犬^[3]、猫^[5]、野猪^[6]等，但在实验小鼠的外科手术中，仅使用舒泰不足以达到麻醉效果。右美托嘧啶是一种相对选择性的α₂-肾上腺素受体激动剂，具有镇静的效果，对其他的中枢抑制剂也有增效的作用^[7]。这两种药物在发挥麻醉功能的同时，也能起到镇痛的作用，但是该镇痛效果不足以满足小鼠肿瘤切除术围手术期疼痛的管理需求。因此我们选择了美洛昔康（Meloxicam），一种烯醇酰胺类新型非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS）,是环氧合酶2（COX-2）的选择性抑制剂，其多用于类风湿性关节炎、抗骨关节炎、慢性炎性反应及镇痛^[8]。美洛昔康对机体的毒副作用小且疗效显著，但有研究表明兽用美洛昔康在犬的临床用药中有12%的临床病例会出现胃肠道副作用^[9]。

因此，本研究的目的是探究舒泰和右美托嘧啶联合美洛昔康对小鼠肿瘤切除术的围手术期镇痛效果及其副作用，以实现动物福利最大化和保障研究结果的准确性。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物：6周龄SPF级BALB/c雌性小鼠14只，每只体质量22~23g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（湘）2019-0004。所有实验操作均符合海南大学动物实验伦理学要求，伦理审批号为HNUAUCC-2022-000144。

1.1.2试剂与仪器：舒泰^®50（VIRBAC公司）、美洛昔康（Boehringer Ingelheim Espana 公司）、右美托嘧啶（江苏恩华药业有限公司）。苏木精-伊红染色液（塞维尔生物科技股份有限公司）、4%多聚甲醛（上海罗恩试剂公司），红霉素软膏（南京白敬宇制药有限公司）。光学显微镜（Phenix）、病理切片机（浙江省金华市科迪仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1荷瘤小鼠的制备：制备乳腺肿瘤小鼠模型，取6周龄BALB/c雌性小鼠，腹部脂肪垫皮肤部位剃毛后表面消毒，皮下注射1.5×10⁶个4T1乳腺肿瘤细胞制成100μL细胞悬液，接种一周后观察肿瘤的生长情况，选取肿瘤体积达到300mm³的小鼠以备进行肿瘤切除。

1.2.2动物分组及术前准备：BALB/c小鼠饲养于海南大学动物实验室，使用许可证号为SYXK（琼）2023-0031，期间各组小鼠自由饮水，饲喂普通维持饲料。饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度恒定，温度控制在25~26℃。手术操作在教学无菌手术室进行。将小鼠随机分为2组：A组：非美洛昔康注射组；B组：美洛昔康注射组。根据文献报道和实验观察，本研究使用的美洛昔康剂量为5mg/kg^[10]。所有小鼠术前禁水2h，并腹部剃毛,A组小鼠腹腔注射舒泰（65mg/kg）和右美托嘧啶（0.1675mg/kg）进行麻醉。B组小鼠除了上述的麻醉药注射外皮下注射美洛昔康。术后7d内，B组小鼠皮下注射美洛昔康，每日1次。

1.2.3荷瘤小鼠的肿瘤切除术：小鼠麻醉诱导后观察小鼠状态，当小鼠后足反射消失，肌肉松弛失去张力且呼吸深、慢但有节奏时，可确定小鼠进入手术麻醉期。麻醉后小鼠体温降低，需使用加热垫保温，在小鼠眼睛部位涂抹适量红霉素眼膏，保持小鼠眼睛润滑。

将小鼠仰卧置于无菌手术台，固定四肢，并用75%酒精棉和碘伏对腹部进行消毒，消毒充分后采用腹中线切口，模拟肿瘤切除手术。用眼科剪分离肿瘤喉切除，创口直径约为1cm。之后用五号手术线对伤口进行简单间断缝合，切口闭合后再次用碘伏对创口进行消毒后，穿上自制手术衣，放置于干净舒适的环境等待苏醒。

1.2.4小鼠面部表情评分系统：小鼠面部表情评分系统（mouse grimace scale）是10年前开发的，作为一种通过表征小鼠面部肌肉特征的变化来评估疼痛的方法^[11]。本研究在术前2周、术前1周、术后5h、1、2、3、4、5、6、7d对每只小鼠进行拍摄，每只小鼠每次拍摄2个视频，分别是3min的脸部特写和10min的行为特征。并从3min高清的脸部特写中使用随机数发生器（www.random.org）随机时间截取高清面部图像，去除小鼠正在梳理毛发的图片，并对图像裁剪，去除身体部分只留下小鼠的面部表情，因为有研究证明身体姿势会对评分造成偏差^[12]。再次使用随机数发生器将选定的图像重新排序，并插入到自定义设计的Excel文件中进行评分，两名评分员需熟知MGS，且不知道实验细节和实验分组情况。

MGS评分细则如下：疼痛小鼠表情（1）耳朵向后折叠，与脸前方成一定角度；（2）一定程度的眯眼；（3）扁平而细长的鼻子；（4）脸颊凸起，脸颊肌肉（眼睛和胡须之间）从基线位置凸出；（5）胡须聚集在一起指向远离脸。无痛小鼠表情（1）圆圆的耳朵面朝前方；（2）不眯眼；（3）圆圆的鼻子；（4）圆圆的脸颊；（5）胡须呈扇形，末端下垂^[12]。但因为在监测过程中胡须这一指标不明显，故舍弃。每个指标评分0~2分，0分代表不存在，1分代表中度可见，2分代表严重。小鼠面部表情得分总分等于4个指标（眼睛、鼻子、耳朵、脸颊）得分的平均分。

1.2.5小鼠疼痛行为：之前有研究表明，6min是可确定手术后行为是否存在差异的时间段^[13]。所以在小鼠10min行为特写视频中，选取3~9min来观察小鼠各个行为出现的次数记录分析（表1）^[14]，前3min给小鼠适应环境的时间。

1.2.6小鼠主要脏器的组织病理学观察：小鼠围手术期观察结束后，实施安乐死并解剖小鼠，取小鼠主要脏器（心脏、肝、脾、肺、肾）以及肠道（十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠、直肠）的肠段5mm纵切后，用4%多聚甲醛固定后再进行脱水、浸蜡、包埋后制成石蜡切片。将石蜡切片脱蜡水化后进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色,并用光学显微镜观察小鼠的组织病理学结构。

1.3统计学分析

小鼠麻醉诱导时间、麻醉维持时间、苏醒时间、表情评分和行为频率采用均值±标准差（x̄±s）表示，统计学方法采用t检验。评分者之间信度用ICC组内相关性分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义。所有数据均用SPSS19.0和GraphPad Prism 5 软件处理。

2结果

2.1小鼠的麻醉诱导时间、麻醉维持时间、苏醒时间

统计学分析结果显示，两组小鼠的麻醉时间和麻醉维持时间无显著差异。与A组相比，注射美洛昔康的B组小鼠的苏醒时间显著延长（P<0.01），提示美洛昔康可以使小鼠苏醒缓慢（表2）。

2.2小鼠面部表情评分

根据MGS评分系统，两个评分者对术后小鼠表情进行评分（图1），结果显示较高的内部一致性（Cronbach's α=0.89）以及组内相关系数（ICC=0.762），表明评分者之间有高信度（图2）。统计学分析显示术前两组小鼠表情评分无显著性差异，B组小鼠在术后5h、术后24h、术后3d、术后5d和术后7d的表情评分较A组显著降低（P<0.05）(图3)，提示美洛昔康能够降低小鼠的围手术期疼痛。

2.3小鼠疼痛行为频率

两种小鼠的术后疼痛行为频率显示：两种小鼠的术前疼痛行为频率无显著差异，在术后5h、术后24h、术后2d，B组小鼠疼痛行为频率较A组显著降低（P<0.001），其他时间点疼痛行为频率无显著差异（图4），提示美洛昔康可以显著减少小鼠围手术期前期的术后疼痛行为。

2.4小鼠的体质量变化

两组小鼠初始体质量无差异，术后24h因肿瘤切除技术后导致小鼠饮食饮水减少，两组小鼠的体质量均出现下降，但是两组间的小鼠体质量无显著性差异（P>0.05）,并在术后1周内逐渐恢复到手术前水平（图5），提示美洛昔康对小鼠术后体质量的恢复无明显影响。

2.5小鼠脏器的组织病理学观察

观察两组小鼠的心脏、肝、脾、肺及肾的组织切片，未见明显病变（图6）。观察两组小鼠的各段肠道组织切片，B组一只小鼠在十二指肠部位发现微小出血点，但各小鼠肠道均无明显出血、炎性反应以及溃疡病灶，且肠道结构完整（图7）。

2.6小鼠死亡情况

在术后第2天，未注射美洛昔康的A组小鼠有一只发生死亡，解剖后发现小鼠胃壁变薄、膀胱尿液充盈，其他脏器完好，无明显损伤与出血。

3讨论

在以小鼠为模型的外科手术中，通常使用麻醉剂来保证小鼠的实验动物福利，但小鼠苏醒后仍承受手术带来的持续性疼痛，容易被人忽略。本研究制备了荷瘤小鼠模型，采用舒泰和右美托嘧啶对小鼠进行全身麻醉。已有研究表示BALB/c小鼠的舒泰麻醉剂量在50~75mg/kg时可迅速且安全地诱导小鼠麻醉^[15]，本研究的预实验中分别设置45、55、65和75mg/kg的剂量对BALB/c小鼠进行腹腔注射麻醉。其中45mg/kg用药剂量不能使小鼠进入麻醉状态，55mg/kg用药剂量不能使一部分小鼠进入麻醉的状态，或者在手术中因疼痛有苏醒迹象，65mg/kg用药剂量可快速且较深度诱导小鼠麻醉，同时手术顺利完成（表2）。综上，故选择65mg/kg的舒泰用药剂量。

在实验过程中，小鼠的疼痛无可避免，但小鼠的疼痛水平常常难以评估，许多常用的疼痛测量是间接的，包括心率、血压和体质量，这些指标都可以被疼痛以外的因素改变，从而影响对疼痛的正确评估^[16]。此外，许多评估方法需要建立在对物种的典型行为有充分地了解后才能准确解释。即使在人类中，导致疼痛的主要原因包括运动、感觉和心理，直到最近才结合起来进行研究或评估。这意味着之前用于评估实验室啮齿动物疼痛的方法可能不是最佳的，因此应该结合使用多种疼痛评估方法来改善其准确度^[14]。2010年学者开发了小鼠面部表情评分系统，这是一种通过描述5个面部特征或动作单位的变化来评估疼痛的方法，通过检测较长持续时间的疼痛，最久在初次伤害后1个月。这项技术已经在广泛的领域中得到了应用，特别是在疼痛和神经科学领域^[17]。故我们选择小鼠面部表情评分系统对小鼠疼痛程度进行监测。同时手术部位在小鼠腹部，故选择了腹部按压地面，腹部扭动等疼痛行为对小鼠进行监测。

美洛昔康是一种新型非甾体药物（NSAIDs）,其产生解热镇痛抗炎的效果是由于抑制了合成前列腺素所必需的COX,COX有两种加工酶COX-1、COX-2，对COX-2的抑制作用是治疗的基础，对COX-1的抑制作用是产生不良反应的原因^[18]，而美洛昔康是选择性抑制COX-2的药物，产生较少的副作用。临床中美洛昔康在小鼠的剂量范围很广（每12~24h，0.3~20mg/kg）^[19]，产生严重的不良反应多是因为使用剂量不当与使用时间延长。根据文献报道，美洛昔康首先注射方式为皮下注射，常用剂量为5mg/kg^[9]。故本文选取最常用的剂量与注射方式来观察美洛昔康对小鼠的镇痛效果及副作用。且在实验中，仅发现1只小鼠十二指肠出现少量的出血点(图7)，但未对小鼠整体状态产生影响，小鼠饮食正常且体质量有增长趋势（图5）。结合小鼠面部表情与疼痛行为频率可以看出美洛昔康的使用能够显著减轻小鼠的围手术期疼痛（图3,4）。术后未注射美洛昔康组有1只小鼠死亡，解剖过程中没有发现明显的致死性因素，因此我们猜测这可能和疼痛诱发的死亡有关。研究发现疼痛可对机体产生显著危害，包括神经内分泌增强；负氮平衡（分解代谢）；脊髓刺激增多导致交感神经紧张性升高，心脏负荷增重（心输出量及心率升高），呼吸频率加快，血管阻力升高；自主神经对腹部脏器的控制紊乱，引起肠梗阻及泌尿功能异常等生理现象^[20]。

本文探究了美洛昔康对荷瘤小鼠模型的围手术期镇痛作用，结果表明舒泰和右美托嘧啶的麻醉方案不能很好地缓解小鼠的围手术期疼痛，但当术前和术后同时给予美洛昔康后，则能显著缓解小鼠围手术期疼痛，降低术后死亡率，且该方案无明显的毒副作用，进而提高了实验动物福利，并保障了实验数据的准确性。同时本研究也提示科研人员在相关研究中可将小鼠面部表情评分系统和疼痛行为作为一种实时方法来判断小鼠状态，及时调整用药方案，从而更好地保障实验动物福利。

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