实验室小鼠是生物医学研究中最常用的动物。根据人道处理指南，已建立了几种血液采样技术。虽然这些程序对血液质量和采样部位组织学改变的影响已被充分研究，但它们对动物福利的影响尚未得到广泛研究。因此，我们的研究旨在比较三种常用血液采样技术对不同动物福利指标的影响，包括生理和行为反应应激参数（包括疼痛测量、笼内行为和筑巢行为）以及探索活动和新物恐惧症。对雄性 C57BL/6J 小鼠进行单次采血，采血部位分别为面静脉、球后窦或尾血管，或分配到相应的对照处理组。虽然所有血液采样技术都会导致血浆皮质酮水平急剧升高，但从面静脉和球后窦采血的动物的反应最强。通过粪便样本中的皮质酮代谢物监测肾上腺皮质活动的时间进程时也观察到了类似的结果。从面静脉和球后窦采血也减少了对新刺激的探索，导致筑巢活动减少，并诱导小鼠鬼脸量表得分升高。此外，面部静脉出血后，运动活动和焦虑相关行为受到严重影响。有趣的是，尾血管出血仅引起评估的生理和行为参数的微小变化。重要的是，所有治疗组中观察到的影响在24小时后均不再可检测到，表明仅存在短期影响。因此，通过从动物的角度出发并全面评估特定采样程序的严重程度，我们的研究结果有助于完善3R概念，并使研究人员能够客观地为特定实验选择最合适且最有利于动物福利的采血技术。

1  研究背景

1.1  数字介绍

实验室小鼠是迄今为止生物医学研究中应用最广泛的脊椎动物物种。在该研究领域，采集血液样本通常必不可少。然而，小鼠采血可能会引起痛苦，影响实验动物的健康和福祉，并可能影响实验结果。因此，出于伦理和科学原因，所采用的采血技术必须尽可能减少小鼠的疼痛和痛苦。

因此，实验动物科学学会和国家研究中动物替换、改进和减少中心等科学组织发布了实验室小鼠常用血液采样技术的建议和指南。除其他方法外，建议从面静脉（面静脉出血，FVB）、球后静脉窦（球后出血，RBB）和尾血管（尾血管出血，TVB）采血用于非终端血液采集 。然而，这些血液采集技术的侵入程度各不相同，首先是因为需要对动物进行麻醉或束缚，其次是因为处理时间可能有很大差异]，这可能会导致动物不同程度的痛苦。

1959 年，Russell 和 Burch 提出了“3R”原则 ，以最大限度地减少生物医学研究中动物的疼痛和痛苦 。为了在实验室小鼠采血方面更进一步，我们进行了深入研究，从动物的角度全面调查了上述三种常用采血技术引起的应激反应。早期研究表明，不同的采样技术会影响血样质量，改变多种生化参数，并导致采样部位不同程度的组织损伤 。然而，以客观、科学可靠的方式评估应激采样程序下的动物福利是一项挑战。在这里，几个参数，特别是关于自发和自然行为的参数，提供了有价值的信息，但在评估实验室小鼠采血技术的研究中经常被忽视。

已有迹象表明，不同的采血程序可能导致自发性行为以及实验诱发的行为和生理参数发生改变；然而，结果尚不明确。这些差异可能是由于所引用的研究在所应用技术的细节、采血频率以及采血后评估生理和行为变化的时间点上存在差异。因此，仍然需要可靠的证据来就最合适、最有利于动物福利的采血技术提出有效的建议。

因此，本研究旨在客观全面地比较上述三种常用采血技术（TVB、RBB、FVB 及其相应的对照处理）对实验小鼠的急性和中期（即处理后 24 小时）影响。为了深入了解这些技术对不同福利相关参数的可能影响，我们在四个独立的实验中评估了各种生理和行为指标。这些实验均在雄性 C57BL/6J 小鼠身上进行。该种小鼠是生物医学研究中最广泛使用的近交系小鼠之一，也是大多数转基因小鼠模型的背景系 ，因此其研究结果具有广泛的应用领域意义。

考虑到三种血液采样技术的侵入程度似乎不同，预计应激激素分泌（即血浆皮质酮和粪便皮质酮代谢物的水平）会有所不同。动物福利下降的进一步指标是自发行为的改变，以及在熟悉和新环境中的焦虑相关行为，我们通过家笼活动测量和标准化行为测试（如旷场测试、新物体探索测试和社会互动测试）对这些指标进行了评估。此外，筑巢行为和筑巢质量可作为动物福利的一项指标，因为实验室小鼠在提供合适的筑巢材料时有很强的筑巢积极性。为了研究不同的血液采样技术是否导致筑巢行为的变化，我们还在采样程序后的几个短期和中期时间点评估了筑巢质量。最近，啮齿动物的面部表情已被用来评估与福利相关的参数 ，因为与人类相似，老鼠也会表现出所谓的痛苦-鬼脸 。这些由疼痛或痛苦引起的面部表情变化可以用小鼠鬼脸量表 (MGS) 来量化，分数的增加是动物福利受损的有力指标]。因此，从动物的角度来看，我们研究了小鼠在使用不同的采血技术后 MGS 评分是否发生变化。我们假设采血技术对所有这些读数的影响不同，与对照治疗相比，侵入性更强的技术导致的损害最为严重。

1.2  血浆皮质酮

血液样本在4°C、4000 g条件下离心10分钟，然后使用市售皮质酮放射免疫分析试剂盒（大鼠/小鼠CORT 125 I RIA试剂盒，DRG Instruments GmbH，德国马尔堡）或皮质酮ELISA试剂盒（EIA 4164，DRG Instruments GmbH，德国马尔堡）分析血浆样本。所有样本均按照制造商的说明进行处理，并略作修改，详见。所有标准品、样本和对照均重复检测。批内和批间变异系数分别低于10%和12%。

1.3  粪便皮质酮代谢物（FCM）

使用 5α-孕烷-3β,11β,21-三醇-20-酮 EIA 分析收集的粪便样本中的免疫反应性 CM。Touma 等人描述了该检测方法的开发、生化特性和生理验证的细节  。此外，所用的 EIA 已被证明非常适合检测小鼠肾上腺皮质活动的微小变化。在进行 EIA 分析之前，将粪便样本在 80°C 下干燥 2 小时。之后，将它们均质化，并用 1 ml 80% 甲醇提取 0.05 g 的等分试样。该检测方法性能的详细描述已在其他地方发表。

2   结果

为了全面评估不同采血技术的严重性，我们在四个独立实验中研究了三种采血技术对动物福利直接和间接指标的影响：急性应激反应（实验 1）和应激反应过程（实验 2）。此外，我们还评估了对运动活动以及在行为测试情况下探索新物体和社会伙伴的急性和中期影响（实验 3 和 4）。再者，我们还检查了家笼行为、筑巢和主观疼痛感知的急性和中期变化（实验 4）。除了三个采血组（尾血管出血 (TVB)、球后出血 (RBB) 和面静脉出血 (FVB)）之外，我们还在每个实验中包括两个相关的对照组（处理对照组 (HCO) 和麻醉对照组 (ACO)）。

2.1  三种采血技术对急性应激激素释放的影响不同

在第一个实验中（见图1A中的示意图），我们研究了急性应激激素反应，即各治疗组在分别治疗后 15 分钟内血浆皮质酮水平是否存在显著差异。事实上，我们发现了治疗的主要效应（F （4,55） = 13.727，p< 0.001，图 2）。与 HCO 组相比，ACO（p = 0.011）、RBB（p< 0.001）和 FVB（p< 0.001）组动物的血浆皮质酮水平显著升高。有趣的是，TVB 组动物与 HCO 组没有显著差异（p > 0.05）。此外，仅接受异氟烷麻醉（ACO）的小鼠的血浆皮质酮反应明显低于 RBB 组动物（p = 0.036）。此外，接受TVB的小鼠血浆皮质酮水平显著低于接受RBB（p = 0.003）和FVB（p = 0.018）的小鼠。RBB组和FVB组的小鼠血浆皮质酮水平最高，且两组之间差异不显著（p > 0.05）。

图 2.采血或对照治疗后 15 分钟的血浆皮质酮水平。

统计学分析：方差分析；事后检验：Bonferroni 检验，每组 n = 12。不同字母表示组间显著差异。数据以平均值和标准误 (SEM) 表示。图表中的基础数值数据可在支持信息（S1 数据）中找到。HCO，操作对照组；ACO，麻醉对照组；TVB，尾血管出血；RBB，球后出血；FVB，面静脉出血。

三种采血技术在数小时内诱导了不同程度的 HPA 轴激活在第二个实验中（见图1B中的示意图），通过监测各处理后 24 小时内粪便皮质酮代谢物 (FCM) 来研究诱导的 HPA 轴应激反应的时间进程。粪便样本每隔两小时采集一次。所有组的 FCM 水平均显示出 HPA 轴活动的昼夜变化规律。然而，重复测量方差分析发现存在显著的时间*处理效应（F (20.12, 276.64) = 2.517，p< 0.001，经 Greenhouse-Geisser 校正，图 3）。粪便样本的预期时间延迟 [ 44 , 45 ]，在采血或对照处理后 6 小时 (F (4,55) = 4.981, p = 0.002)、8 小时 (F (4,55) = 12.200, p < 0.001) 和 10 小时 (F (4,55) = 5.116, p= 0.001) 检测到了治疗的主效应（图 3）。事后分析显示，FVB 6 小时后，FCM 浓度明显高于 HCO 组 (p = 0.006) 和 ACO 组 (p = 0.023)。分别处理8小时后，RBB组和FVB组小鼠的FCM浓度显著高于HCO组（RBB：p < 0.001，FVB：p< 0.001）、ACO组（RBB：p = 0.049，FVB：p= 0.002）和TVB组（RBB：p = 0.022，FVB：p  = 0.001）。分别处理10小时后，RBB组和FVB组小鼠的FCM浓度仍然显著高于HCO组小鼠（RBB：p = 0.049，FVB：p = 0.001）。

图 3.采血或对照治疗后 24 小时内监测粪便皮质酮代谢物。

三种采血技术对运动、探索和焦虑相关行为以及急性和恢复期血浆皮质酮水平有不同的影响。在第三个实验中（参见图 1C中的示意图），小鼠在接受相应治疗后立即接受了三项不同的行为测试。动物依次进行了旷场测试 (OF)、新物体测试 (NO) 和社会互动测试 (SI)，每项测试持续 5 分钟。这些行为测试结束后，进行了两次血浆皮质酮测量，分别在行为测试后立即进行（t = 15，急性反应值）和 60 分钟后进行（t = 75，恢复值）。所有五个治疗组均采用 TVB 技术进行了这两次血液采样。

图 4.采血或对照治疗后立即进行的运动活动和焦虑相关行为。

在开放场、新物体和社会互动测试中，计算了运动（A）和焦虑（B）的Z 分数。统计：方差分析，如果方差不等，则使用 Welch 检验；事后检验：如果方差不等，则使用 Bonferroni 或 Games-Howell。组间显著差异用不同的字母表示。n（HCO）= 10，n（ACO）= 10，n（TVB）= 9，n（RBB）= 11，n（FVB）= 11。数据以平均值和 SEM 表示。每个图表的基础数值数据可在支持信息（S1 数据）中找到。HCO，处理对照；ACO，麻醉对照；TVB，尾血管出血；RBB，球后出血；FVB，面静脉出血。

焦虑相关行为的z值显示，RBB和FVB处理的动物表现出的焦虑相关行为水平明显高于HCO处理的动物（Games-Howell事后分析：RBB vs HCO：p = 0.005，FVB vs HCO：p = 0.044）。此外，与ACO组相比，RBB处理的小鼠焦虑相关行为明显增多（Games-Howell事后分析：p = 0.014）。这些影响在不同处理24小时后不再可检测到（在不同批次的动物中测试，见实验4，运动z值：F (4,44) = 0.719，p = 0.343，焦虑z值：F (4,44) = 1.129，p = 0.355）。在S1和S2表可以找到三项行为测试中量化的各种参数的即时和中期影响的数据和统计分析。

关于血浆皮质酮测量，对于急性反应值和恢复值，均检测到治疗的显著主效应（F （4,46） = 20.549，p < 0.001 和 Welch's F （4, 21.81） = 27.688，p < 0.001；图 5）。与所有其他组相比，HCO 动物的急性血浆皮质酮反应最低（Bonferroni事后分析：ACO：p = 0.001，TVB：p = 0.001，RBB：p < 0.001，FVB：p < 0.001；图 5）。除了显示出比 HCO 动物更高的皮质酮水平外，接受 FVB 治疗的小鼠的血浆皮质酮水平也比 ACO（p = 0.002）和 TVB（p= 0.003）动物明显升高。与所有其他组相比，HCO 组的恢复值再次显著较低（Games-Howell事后分析ACO：p = 0.002，TVB：p = 0.002，RBB：p < 0.001，FVB：p < 0.001；图 5）。此外，与 ACO 和 TVB 组相比，接受 RBB 或 FVB 治疗的动物的皮质酮水平显著较高（Games-Howell事后分析：RBB vs ACO：p = 0.007，RBB vs TVB：p = 0.010，FVB vs ACO：p < 0.001，FVB vs TVB：p = 0.001；图 5）。

图 5.各治疗后基线（0 分钟）、急性期（15 分钟）和恢复期（75 分钟）血浆皮质酮水平。

三种采血技术对筑巢、疼痛感知和笼内行为有显著影响。在第四个实验中（见图1D中的示意图），我们使用 Deacon [ 37 ]描述的筑巢测试方案评估了不同处理组小鼠的筑巢行为。此外，我们还应用了小鼠鬼脸量表 (MGS) [ 40 ] 来评估疼痛相关行为，并研究了动物在家笼中行为的变化。

在相应治疗之前立即评估巢穴质量（基线值），在治疗后立即评估 10 小时的时间过程（每隔两小时评估一次）（急性效应），并在治疗后 24 小时再次评估巢穴质量（中期效应）。五个不同治疗组的基线巢穴得分没有差异（Kruskal-Wallis H 检验：χ2 = 1.947，df = 4，p = 0.763；图 6）。在实验治疗后立即的十个小时内，所有组的巢穴得分都显著增加（Friedman 检验：χ2 = 30.715–38.321，df = 6，p < 0.001；图 6）。在不同采样点进行的治疗之间的比较显示，相应治疗后四小时存在显着差异（χ2 = 16.422，df = 4，p = 0.003）。与接受ACO的小鼠相比，RBB组和FVB组的小鼠筑巢得分显著较低（RBB：p = 0.023，FVB：p = 0.038，Bonferroni校正的Mann-Whitney U检验）。然而，24小时后，各治疗组之间的筑巢得分无显著差异（Kruskal-Wallis H检验：χ² = 2.269，自由度= 4，p = 0.714），大多数小鼠的得分为4或5，与基线值相似（图6）。

图6.采血或对照处理对筑巢行为的影响。

在相应治疗之前（时间点 0）和之后对巢质量进行评分。治疗后立即提供一个新的巢，并每 2 小时对鸟巢质量进行一次评分，持续 10 小时，并在 24 小时后再次评分。鸟巢质量得分可达 1（巢质量差）至 5（巢质量极好）之间。在相应治疗 4 小时后检测到组间鸟巢质量存在显著差异 (* p < 0.05)。接受 RBB 和 FVB 的动物与 ACO 组的动物有显著差异 (RBB：p = 0.023；FVB：p = 0.038)。统计：Kruskal-Wallis H 检验，随后是事后分析（Bonferroni 校正的 Mann-Whitney U 检验），在时间点“0”：每组 n = 8；在其他所有时间点 n (HCO) = 10, n (ACO) = 10, n (TVB) = 10, n (RBB) = 10, n (FVB) = 9。数据以平均值±SEM表示。该图的基础数值数据可在支持信息（S1 数据）中找到。HCO，处理对照组；ACO，麻醉对照组；TVB，尾血管出血；RBB，球后出血；FVB，面静脉出血。

为了评估动物的主观疼痛感知，在相应治疗后 5 分钟内，利用 MGS 评分方案对它们的面部表情进行评分 [ 40 ]。在这里，检测到了治疗的主效应（Welch's F （4,20.41） = 9.127，p < 0.001；图 7）。事后检验显示，与 HCO 组相比，接受 ACO、FVB 或 RBB 治疗的小鼠的 MGS 评分明显较高（Games-Howell事后检验：分别为 p = 0.004、p = 0.030 和 p = 0.015）。虽然接受 TVB 的动物与 HCO 组和 FVB 组没有显著差异（Games-Howell：p = 0.813 和 p = 0.056），但与 ACO 组（p = 0.014）和 RBB 组（p = 0.036）相比，检测到的 MGS 评分有显著差异。 ACO、RBB 和 FVB 组之间没有显著差异（ACO 与 RBB p = 0.466、ACO 与 FVB p = 0.338、RBB 与 FVB p = 0.973）。

图 7.采血或对照治疗对小鼠鬼脸量表评分 (MGS) 评估的疼痛感知的影响。

根据与基线相比的变化（0 = 无变化，1 = 中度，2 = 重度）[ 40 ]，对四种不同的面部特征（眼眶收紧、鼻部凸起、脸颊凸起和耳朵位置）进行评分；因此可以达到的最高分是 8 分。统计分析：采用 Welch 检验的方差分析；事后检验：Games-Howell。不同字母表示组间显著差异。n (HCO) = 10，n (ACO) = 9，n (TVB) = 9，n (RBB) = 10，n (FVB) = 9。数据以平均值和 SEM 表示。该图的基础数值数据可在支持信息（S1 数据）中找到。HCO，处理对照；ACO，麻醉对照；TVB，尾血管出血；RBB，球后出血；FVB，面部静脉出血。

为了评估采血对动物在家笼中自然行为的影响，我们在三个时间点分析了它们 60 分钟的活动：相应治疗前 24 小时、治疗后立即进行和治疗后 24 小时。在采血和对照治疗前一天，动物在家笼中的行为没有显著差异（见S3 表）。然而，在采血当天，发现治疗组之间的几种行为存在显著差异（见表 2）：治疗组和对照组的梳理时间有显著差异（χ2 = 11.598，df = 4，p = 0.021）。事后检验显示，接受 FVB 的小鼠比 HCO 组的小鼠表现出更多的梳理行为。此外，治疗组和对照组在站立次数方面有显著差异（χ2 = 14.61，df = 4，p = 0.006）。 FVB 组小鼠的直立次数明显少于 ACO 组小鼠（p = 0.018）。此外，我们还观察到，在表现出驼背身体姿势时，动物静止时间存在显著差异（χ2 = 26.058，df = 4，p < 0.001）。这种行为几乎只出现在接受 FVB 治疗的小鼠中，而 RBB 组小鼠的表现程度较低（FVB 与 HCO：p < 0.001，FVB 与 ACO：p < 0.001，FVB 与 TVB：p < 0.001，FVB 与 RBB：p = 0.015）。此外，不同治疗方案对筑巢活动时间有显著影响（χ2 = 9.726，df = 4，p = 0.045），但这种影响在事后分析中并不显著。

有趣的是，采血一天后，筑巢行为仍然显著差异（χ² = 9.902，自由度 = 4，p = 0.042）。事后分析显示，前一天接受FVB的小鼠筑巢时间显著少于RBB组小鼠（p = 0.037）（见S3表）。

三种采血技术对体重、皮毛状态和食物摄入量均无影响

体重、食物摄入量和皮毛状态也被评估为动物福利的额外指标。总体而言，在任何实验中，动物的体重在采血或对照处理后均未发生变化（实验2-4，见表3）。

3  讨论

本研究旨在探究三种常用小鼠采血技术对动物福利的影响。通过一系列全面的实验，我们运用严谨的设计，证明了使用这三种技术进行单次采血确实会对动物的应激生理和行为产生差异性影响，并持续引发不同程度的痛苦，从而影响与动物福利评估相关的参数。这些影响在FVB和RBB之后似乎更为显著。因此，我们的研究结果表明，TVB比其他两种应用技术更有利于动物福利。

虽然 5 个治疗组之间的体重、皮毛状态和食物摄入量没有显著差异，但检测到了显著的皮质酮反应（图2、3和5）。与基线相比，所有组的血浆皮质酮水平均有所升高。在处理对照组和 TVB 组中，处理 15 分钟后的反应值最低。FVB 和 RBB 显示出最急剧的增幅，同时也显示出较慢的恢复/延长的激活时间，这由处理 75 分钟后血浆皮质酮水平仍然升高所证明。由于血浆糖皮质激素水平是应激反应程度的指标 [ 51 ]，这些结果表明，与 TVB 或对照组相比，实验小鼠对 FVB 和 RBB 的应激反应更强烈。尽管异氟烷麻醉本身比处理引起的应激反应更强烈，但单靠麻醉无法解释在接受 RBB 的动物中观察到的大幅增加，因为这两组之间存在显著差异。粪便皮质酮代谢物的分析进一步支持了这些结果。暴露于刺激后 8-10 小时排泄的皮质酮代谢物反映了 HPA 轴对此压力源的反应活动。事实上，在相应治疗后6小时开始，接受 FVB 的动物的 FCM 水平明显高于 HCO 动物。8 小时后，这种影响更加明显：与处理对照组、麻醉对照组和 TVB 相比，FVB 和 RBB 处理的 FCM 水平明显更高。10 小时后，RBB 和 FVB 与处理对照组有显著差异。由此可以得出结论，与 TVB、HCO 和 ACO 相比，面静脉和球后静脉窦采血的压力明显更大。这些发现与其他研究组报告的结果一致。例如，Madetoja 及其同事证明，与从面静脉和隐静脉取样相比，接受尾部血管放血的雌性小鼠血浆皮质酮水平的升高幅度较小。同样地，其他研究表明，与麻醉下剪尾和眶后穿刺相比，不受束缚的剪尾导致血浆皮质酮水平较低；而与尾尖切断相比，RBB 和舌下穿刺后的血浆皮质酮浓度较高，

与血浆皮质酮和 FCM 水平的差异一致，接受 FVB 和较小程度 RBB 的动物表现出行为的显著变化（在实验环境和家笼中）。总体而言，在 FVB 之后，小鼠表现出运动活动减少，对新物体或社交伙伴的兴趣降低，如旷场、新物体和社交互动测试所示。在 RBB 之后，发现对新刺激的探索有类似的影响，小鼠似乎会避开仪器的中心。然而，RBB 组动物的整体运动活动并没有减少。有趣的是，24 小时后不再观察到这种行为改变。这些发现表明，虽然 FVB 和 RBB 会改变运动活动和探索，但这些都是急性影响，似乎不会产生中期或长期影响。

运动能力的急剧下降也与动物饲养笼中的观察结果相符。在饲养笼中，小鼠不受干扰，并记录其行为一小时。虽然各治疗组之间的一般运动能力并无差异，但令人惊讶的是，一些小鼠长时间保持驼背姿势不动（即弯腰驼背，背部弯曲度增加，耳朵向后拉，四肢缩进身体下方）。这种行为几乎只出现在经历FVB的小鼠中，而经历RBB的小鼠则较少出现。这种姿势被视为小鼠疼痛和痛苦的指标，并对动物的福祉产生重大影响。一项比较尾静脉切开术、尾尖截肢术或面静脉穿刺采血方法的研究也表明，在采血后的10分钟内，FVB导致不活动（即至少15秒的静止或僵住）发作频率增加[ 26 ]。本研究显示，接受RBB的动物也观察到不活动情况增加。

此外，FVB 组小鼠在笼中比处理对照组小鼠明显更多地进行梳理，这可能是由于 FVB 组小鼠经历了抓挠颈部和颅面区域疼痛的感觉。观察 24 小时内筑巢活动的时间进程时，很明显，在相应的处理后四小时和六小时，FVB 和 RBB 表现出较低的筑巢分数，即筑巢质量下降。此后，筑巢分数不再有差异。筑巢活动活跃可以解释为动物所有需求都得到满足的标志，反之，筑巢活动减少则表明福利下降  。这进一步证明 FVB 和 RBB 会影响小鼠的福利，因为它们在采血后的最初几个小时内建造的巢穴质量明显较差。在其他研究中，不同的采血技术，例如无限制剪尾、尾血管放血、眼球后放血和面静脉放血，并没有导致筑巢行为的差异。然而，在这些研究中，筑巢质量是在采血后 10 小时 或 24 小时 进行评分的，这与我们的发现一致，因为我们同样观察到治疗后 6 小时以上没有显著差异。此外，将筑巢材料整合到现有巢穴中的时间似乎在手术干预后有所延长，进一步证实了我们的发现。相反，另一项研究可能表明，对照组和 FVB 治疗组的筑巢行为相似，而在 TVB 和 RBB 治疗后筑巢行为显著减少。这种差异的一个解释可能是，为了从尾血管采集血液，该研究中的小鼠被物理束缚在束缚盒中。虽然没有被固定，但这种束缚可能比我们研究中简单地抓住自由活动的小鼠尾巴引发更高程度的痛苦。

从 MGS 评分来看，很明显 FVB 和 RBB 似乎能引起实验小鼠最强烈的应激反应。MGS 最初是为评估疼痛而开发的，但它也能反映应激暴露。经历 FVB 和 RBB 的小鼠的 MGS 评分最高，而且这些是唯一与处理对照组有显著差异的治疗方法。然而，不能排除观察到的差异是由 FVB 和 RBB 期间对面部区域的操作引起的。但是，治疗仅针对面部的一侧进行，而 MGS 评分则观察两侧；因此，我们认为这种潜在影响很小，并未完全危及 MGS 测量。有趣的是，虽然并不显著，但接受 TVB 的动物与 ACO 小鼠相比，MGS 评分较低。看来，短暂的麻醉就会对 C57BL/6J 小鼠的面部表情产生影响。这些结果与关于异氟烷暴露后品系特异性对MGS评分影响的报道一致[ 61 ]。有趣的是，其他研究发现，单次和重复异氟烷麻醉后，雌性小鼠的影响更明显，而雄性小鼠的影响则没有[ 60 ]，而单次和重复氯胺酮和赛拉嗪麻醉在雄性和雌性小鼠中均产生了显著更高的评分。

综合考虑这些行为变化，我们可以清楚地看出，从面部静脉采血以及在较小程度上从球后窦采血会导致与福利相关的变化，这些变化通常体现在小鼠活动减少上。小鼠活动模式的这种改变被认为是痛苦的征兆 。与我们的发现类似，接受面部静脉放血的小鼠也表现出跑轮行为的减少，而跑轮行为最近被建议作为评估实验室小鼠病情严重程度的工具。

总体而言，很明显，在动物面部区域（RBB、FVB）进行的采样方法对小鼠的行为和应激生理有更不利的影响。这些结果可以通过这些方法的侵入性更高来解释，即除了静脉穿刺外，还需要抓住颈背和麻醉。另一个解释可能是对疼痛的感知。在人类中，面部区域的疼痛通常被认为比身体疼痛更强烈，而颅面疼痛在质量上与颅外伤害感受不同 。最近的研究表明，啮齿动物也可能存在这种情况。因此，与从身体其他部位（例如尾巴）采样相比，小鼠颅面区域的血液采样可能引发更强烈的情感疼痛。

4  结论

综上所述，我们研究中提供的数据提供了充分而全面的证据，表明三种常用的采血技术（TVB、RBB、FVB）对动物的影响不同。使用 FVB 进行一次采血已经导致生理和行为压力参数的显著变化，这与动物福利降低有关。RBB 在同一方向上导致了类似的结果。这些影响在相应的处理后（即采血后的最初几个小时内）迅速显现，但 24 小时后就不再可检测到，表明只有短期影响。有趣的是，TVB 对动物的影响最小，并且大多数情况下不会引起与处理对照组的显著偏差。因此，如果只需要相对较少的血量（最多 150 μl）并且血样（从皮肤表面采集）的质量不会干扰生化读数，根据我们的结果，TVB 是最有利于动物福利的技术。因此，通过从动物的角度出发，全面评估特定采样程序的严重程度，我们的研究结果对3R概念的完善做出了重要贡献。这使得研究人员能够客观地为特定实验选择最合适、最有利于动物福利的采血技术。