动物模型是药物开发和评估的核心：所有候选疗法均使用动物进行毒性、药代动力学/药效学 (PK/PD) 和疗效评估。此外，当出于伦理原因无法进行疗效人体试验或自然病例数量不足时，例如对于生物威胁剂的疗法，美国食品药品管理局可根据 21 CFR 314 (“动物规则”) 允许仅在动物模型上评估疗效后才颁发许可证。自 2002 年颁布以来，该规则已在有限数量的案例中适用，包括用于治疗吸入性炭疽病的 Raxibacumab、用于治疗氰化物中毒的 B12、用于治疗神经毒气的吡斯的明以及用于治疗鼠疫的左氧氟沙星和莫西沙星，但越来越多的疾病的治疗方法正在通过这种模式进行评估。毫不奇怪，动物模型并不是人类的完美替代品。从广义上讲，大多数疾病仅影响有限数量的物种。对这些疾病进行建模本身就具有挑战性，研究人员使用各种技术来弥补这些缺陷，例如分别使用小鼠适应病毒和免疫功能低下或基因突变小鼠作为病毒和癌症模型，但这些模型无法准确重现人类的疾病进展。

此外，即使模型从广义上（例如通过物理检查）似乎可以反映某种疾病，但不同物种之间细胞受体或激酶功能等细节上的差异可能会对治疗方法的评估产生不利影响。例如，人类 CD16（III 型 FCγ 受体）与 IgG1 和 IgG3 相互作用，而恒河猴 CD16 却与 IgG1 和 IgG2 相互作用；恒河猴粒细胞中不存在 CD16 。这些差异可能会干扰通过这种 FCγ 受体起作用的治疗性抗体的评估 。在系统层面上，人类和小鼠对烧伤、创伤和内毒血症的转录组反应几乎没有相关性，强调这些物种已经进化出独特的机制来治愈和对抗疾病。虽然一些直系同源基因的表达模式在不同物种之间可能大致相似，但许多基因具有不同的表达模式；调节元件在物种间的保守性尤其低，谱系特异性反应也是如此 。针对这些受体和通路的生物治疗药物的日益普及，凸显了了解动物模型和人类之间免疫信号分子和细胞差异的重要性。

物种间蛋白质表达的差异也会对安全性测定产生重大影响。例如，Fialuridine (TGN1412，CD28 超激动剂抗体) 最初在四种动物模型 (小鼠、大鼠、狗和猴子) 中进行了评估，但当以动物安全剂量的 1/500 给人类服用时，由于物种间 CD28 表达的差异，该药物引起了灾难性的器质性衰竭。还必须考虑临床试验中使用的人类人口统计学群体在年龄、性别、种族、免疫史、遗传学等方面的差异。这些差异可能比动物模型和人类之间的差异更容易被认识到：美国食品药品监督管理局自 1998 年以来就要求新药申请按性别、年龄和种族描述安全性和有效性，2004 年至 2007 年批准的 38% 的药品标签包括按种族划分的 PK/PD 数据。已知华法林、瑞舒伐他汀、他克莫司、卡马西平等药物具有种族依赖性的 PK/PD。激素、体脂和血流等多种因素都会导致药物的生物利用度、分布、代谢和排泄存在性别差异。这些问题凸显了了解物种内和物种间免疫学差异的必要性。

非人类灵长类动物 (NHP) 与人类相似，是药物开发的重要组成部分。许多关键的免疫学检测利用抗体来区分特定细胞类型并量化信号传导部分。很少有抗体是针对非人类灵长类动物抗原产生的；相反，研究人员通常使用与他们正在研究的非人类灵长类动物物种交叉反应的抗人抗体。为了帮助研究人员找到用于 NHP 研究的抗体，美国国立卫生研究院支持了一个非常有价值的数据库，其中包含市售抗体与 13 种 NHP 物种的交叉反应 ( http://www.nhpreagents.org )。该数据库来自制造商和研究人员的报告，通常提供一个简单的“是/否”声明，说明克隆是否会染色某个物种，偶尔会评论染色强度或特异性。虽然这是一个无价的资源，但数据库的覆盖范围有限。例如，在本研究之前，仅在非洲绿猴中评估了 28 种 CD 标记。

此外，除了少数例外，数据库缺乏有关交叉反应抗体所结合的细胞类型的信息，并且已知有许多抗体克隆结合不同物种的不同细胞类型的实例。例如，已知粒细胞和单核细胞标志物的表达在人类和非人类灵长类动物中存在很大差异。NIH 数据库和制造商的数据表报告称，抗人 CD33 克隆 AC104.3E3 与恒河猴和食蟹猴有交叉反应，但我们的实验室和其他实验室确定，在这些物种中，它主要染色粒细胞 ，而在人类中，它会染色单核细胞和经典树突状细胞。另一个例子是，Fcγ 受体 CD16 存在于人类和乌白眉猴的粒细胞中，但不存在于恒河猴或狒狒中，这可能会影响评估治疗性抗体的动物研究，因为治疗性抗体可能与该 Fcγ 受体结合、通过该受体传递信号并介导内化。另一个例子是 CD56，它在恒河猴的单核细胞中表达，但在人类中是典型的 NK 细胞标记物。因此，研究人员必须通过文献综述或实验验证来确认他们使用的每个克隆都染色了目标细胞群。

扩大灵长类交叉反应数据的广度和深度。我们在人类和四种 NHP 物种的血液中筛选了 332 种单克隆抗体：恒河猴 ( Macaca mulatta )、食蟹猴 ( Macaca fascicularis )、非洲绿猴 ( Chlorocebus aethiops ) 和橄榄/黄狒狒 ( Papio hamadryas anubis x Papio hamadryas cynocephalus杂交种)；并发现每个物种中有超过 120 个克隆对一个或多个种群进行染色。此外，我们还加入了反染色抗体，使我们能够确定至少五个主要免疫细胞群的染色特异性。此数据集可在https://flowrepository.org（accession FR-FCM-Z2Z7）。

我们利用此次筛选的结果创建了第一个适用于人类和一组常用动物模型的通用跨物种质谱流式细胞表型和信号转导面板。为了证明这些面板能够在治疗评估过程中检测出不同物种之间的相似性和差异性，我们对 86 名健康人类、32 只恒河猴 ( Macaca mulatta )、32 只食蟹猴 ( Macaca fascicularis ) 、24 只非洲绿猴 ( Chlorocebus aethiops ) 和 50 只 C57BL/6 小鼠 ( Mus musculus ) 的全血进行了磷酸化流式免疫信号转导分析，在用 15 种刺激物进行处理后，使用质谱流式细胞术测量了 12 个免疫细胞群中每个细胞的 16 种信号蛋白和 24 种表面标志。表型分析面板旨在划分所有物种中的直系同源群体，而信号面板和互补刺激则针对先天免疫和细胞因子反应。我们在此概述了这种跨物种分析，包括物种间具体差异的几个例子。Fragiadakis 等人详细分析了人类数据集，包括对人口统计学差异的检查，为人类免疫分析研究提供了参考。完整的免疫表型和信号数据集可在https://flowrepository.org（accession FR-FCM-Z2ZY）上在线获取。

2   材料和方法

静脉人体血液来自斯坦福血液中心、AllCells Inc.（加利福尼亚州阿拉米达）或根据 IRB 批准的协议从斯坦福社区的志愿者处获取。

所有动物血液均按照获批准的动物护理和使用规程采集。猕猴血液（Macaca mulatta和M. fascicularis）来自 Valley Biosystems, Inc.，采集自清醒（未注射镇静剂）、圈养出生、中国产的动物。我们获取了猕猴的健康报告，可在实验数据储存库中查阅。非洲绿猴（Cercopithecus aethiops）血液来自 Bioreclamation, LLC（纽约州韦斯特伯里）和 Worldwide Primates, Inc.。非洲绿猴是在圣基茨野外出生的；年龄根据捕获日期估算（假设捕获时两岁）。狒狒血液来自西南国家灵长类动物研究中心，该中心由国家研究资源中心（p51 RR013986）资助，并由研究基础设施项目办公室/OD P51 OD011133 提供支持。小鼠来自 Charles River Laboratories。动物实验按照经批准的动物护理和使用委员会协议（#26675）进行。全血细胞计数（CBC）在 Sysmex XT-2000iv 上进行，配有兽医软件模块。

对于所有物种，将全血收集在肝素钠管中，在环境温度下储存/运输（采用隔热措施以防止温度变化），并在收集后 24 小时内进行处理，以进行流式细胞术抗体筛选或刺激和染色以进行质谱流式细胞术，如下所述。

2.1  流式细胞术抗体筛选

将 8 至 10 ml 血液轻轻固定，然后在室温下与 792 µl 16% 多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，宾夕法尼亚州哈特菲尔德；最终浓度约为 0.3%）和 29.6 ml VersaLyse（Beckman Coulter，加利福尼亚州布雷亚）孵育 10 分钟，然后使用 PBS 中的 0.01% BSA（“染色缓冲液”）清洗一次。将细胞悬浮在 6.5 ml 染色缓冲液中，然后与 0.5 ml 人类 TruStain FcX Fc 受体阻断溶液（Biolegend，加利福尼亚州圣地亚哥）孵育 10 分钟。

然后加入五种复染抗体：500 µl CD3 (SP34.2)-Brilliant Violet 421 (BD Biosciences, San Jose, CA)、500 µl CD20 (2H7)-Brilliant Violet 605 (Biolegend)、1000 µl CD66 (TET2)-APC-Vio770 (Miltenyi, San Diego, CA)、500 µl CD11b (ICRF44)-PerCP/Cy5.5 (Biolegend) 和 500 µl CD7 (M-T701)-APC (BD Biosciences)，最终体积为 10 ml。

后续步骤在自动化平台上进行，包括 Agilent Bravo 96 通道移液机器人、离心机、BioTek ELx405 96 通道抽吸器/分配器和 Thermo Scientific MultiDrop 分配器。使用 MultiDrop 将抗体混合物中的 20 微升细胞分配到 384 孔板的每个孔中。使用制造商推荐的 25 µl 水对 LegendScreen 人 PE 抗体筛选板 (Biolegend) 进行再水化。筛选板由四个 96 孔板组成；将每个孔中的 5 µl 以四分之一的方式转移到单个 384 孔板中。将染色反应在室温下黑暗中孵育 30 分钟，以 2.0 mm 半径的轨道振荡，然后用染色缓冲液清洗三次，并使用 HTS 自动进样器在具有 405、488 和 633 nm 激光的 BD LSR II 上采集。

使用 CellEngine ( https://cellengine.com ; CellCarta; Montreal, QC)对文件进行门控并导出细胞群。每个孔都按时间手动进行门控以排除由气泡或碎片引起的异常：排除 PE 通道中信号随时间不一致的时间区域。然后按照结果部分所述对细胞群进行门控。细胞群门控针对每个物种量身定制；无需针对物种内的个体供体进行定制。抗体筛选的其余分析（统计计算、不一致重复分辨率、验证和报告）使用Mathematica（Wolfram Research，Champaign, IL）进行。

2.2  刺激

所用的刺激物如表 S5所示。在人类全血中对一系列浓度的人类和非灵长类动物刺激物进行了测试，以选择工作浓度。同样在小鼠血液中测试了小鼠刺激物。所有刺激物都经过稀释，以使每种刺激物的相同体积都能达到所需的刺激浓度，然后分装到一次性刺激物板中并储存在 -80 ℃ 下，标有 * 的刺激物除外，这些刺激物在使用时由于储存要求或需要调整刺激物浓度而分配。通过 LAL 方法对所有细胞因子进行内毒素测试，并验证其含量低于我们的磷酸流分析可检测到的量（约 10 pg/ml）（未显示数据）。

LPS 是通过苯酚-水提取法商业制备的，含有少量可激活 TLR2 的其他细菌成分。之所以选择特定类型的 LPS（源自大肠杆菌O111:B4 的长链），是因为它来自临床病例中更常见的致病菌株 。

恒河猴/食蟹猴 IL-2 来源于 NIH/NCRR 资助的非人类灵长类动物免疫试剂资源。

γ-灭活的炭疽芽孢杆菌营养株Ames (ANG-BACI008-VE) 由美国国防部关键试剂计划通过美国国立卫生研究院生物防御和新发感染研究资源库 (NIAID)、美国国立卫生研究院获得。

除非另有说明，扎伊尔埃博拉病毒样颗粒均在生产后 48 小时内使用，因此在整个项目过程中使用了不同的批次。颗粒是按照 (Johnson 等人，2006) 使用磷酸钙代替 Lipofectamine 生产的。简而言之，通过磷酸钙法将 1 µg pCAGGS-GP、1 µg pCAGGS-VP35、1.5 µg pCAGGS-NP 和 1.5 µg pCAGGS-VP40（由 R. Johnson 等人，NIH NIAID 综合研究设施提供）转染到 293T 细胞中，36 小时后收获，然后通过 20% 蔗糖垫在 115,605 x g下纯化 2 小时并储存在 4度下。蛋白质自组装成类似于天然病毒体的结构。这些颗粒本质上具有复制缺陷，当施用于非人类灵长类动物时会引起疫苗免疫反应，此外还会引发I型干扰素和促炎细胞因子表达。为了验证该生产方法在我们手中有效，通过蛋白质印迹法验证制剂中含有四种蛋白质中的每一种，并通过电子显微镜验证其形态和数量。后续制剂用电子显微镜进行抽查。为了进行颗粒定量和形态观察，将VLP颗粒制剂与已知浓度的110nm乳胶球（Structure Probe，Inc.，West Chester，PA）混合，吸收到制备成两份的铜碳-Formvar涂层的300目电子显微镜网格上，并用醋酸铀酰染色（协议由J.Birnbaum，NIH NIAID综合研究机构提供）。由于粒子的保质期较短，网格通常在用作刺激物后进行成像。

2.3  质谱流式抗体

购买纯化抗体，并使用 DVS/Fluidigim MaxPar X8 金属偶联试剂盒（表 S2 ）进行内部偶联。所有抗体都经过滴定以获得最佳信噪比，然后在每个物种的至少两个不同个体（三个人、两个食蟹猴、两个恒河猴、三只小鼠）中重新确认。所有偶联和滴定都有详细记录，可根据要求提供记录。最后，由 BioLyph LLC（明尼苏达州霍普金斯）将抗体与赋形剂 B144 一起冻干成 LyoSpheres，形成 4x 混合物。CyTOF 抗体 LyoSpheres 经过一年多的压力测试，发现染色没有显著变化（未显示）。

2.4  质谱流式细胞术的刺激和染色

刺激和染色是在定制自动化平台上进行的，该平台由 Agilent Bravo 移液机器人、Agilent BenchBot 机械臂、Peak KiNeDx 机械臂、Thermo Cytomat C2 培养箱、BioTek ELx405-UVSD 抽吸器/分配器、BioTek MultiFlo FX 四试剂分配器、Q.Instruments 微孔板振荡器、Velocity11 VSpin 离心机和包含在负压生物安全罩内的定制冷却系统组成。VWorks 机器人程序和协议运行日志可应要求提供。

将全血 (330 𝜇l) 加入并混合刺激物 (20 𝜇l) 中，然后在 37 度、5% CO 2 的加湿培养箱中孵育 15 分钟，以进行刺激。在室温下用 1.6% 多聚甲醛 (PFA，电子显微镜科学) 固定血液 10 分钟，然后在室温下用 PBS 中的 0.1% Triton-X100 裂解血液 30 分钟。用 PBS 洗涤细胞两次，然后根据对每个供体的 16种条件进行条形码编码。简而言之，用 0.02% 皂苷使细胞通透，然后用功能化的稳定钯同位素的独特组合进行染色。然后将包含 6个供体 x 16 种条件的刺激板减少到 6 个孔，每个孔包含一个供体的 16 种条件。用染色介质（CSM：PBS 中的 0.2% BSA 和 0.02% 叠氮化钠）清洗细胞一次，用人（人类，NHP）或小鼠（小鼠）TruStain FcX 阻断剂（Biolegend）在室温下振荡封闭 10 分钟，然后在室温下用再水化的细胞外 LyoSpheres 染色 30 分钟，振荡，最终体积为 240 µl。（请参阅表 S2了解最终染色浓度。）清洗细胞一次，然后在 4 摄氏度下在 >90% 甲醇中透化 20 分钟。清洗细胞四次，然后在室温下用细胞内溶球染色 60 分钟，振荡。清洗细胞一次，然后放入 4 摄氏度的 PBS 中的 1.6% PFA 和 0.1 µM 天然铱嵌入剂（Fluidigm）中，直到在 CyTOF 上获取。除少数例外，细胞均在染色后七天内采集。从之前的验证实验来看，这段时间对染色没有显著影响。

2.5  质谱流式细胞术采集

运行前，用水清洗细胞两次。样品是在配备超级采样器样品引入系统 (Victorian Airship & Scientific Apparatus LLC) 的单个 DVS/Fluidigm CyTOF 2 上采集的。在每个条形码样本之间在 CyTOF 上运行 QC 报告。在开始采集之前，仪器必须显示 Tb159 双重计数 > 1,000,000 和氧化 < 3%；如果仪器不符合这些标准，则根据需要进行清洁、调整或维修。每个样本采集了大约 4,800,000 个事件。使用数据标准化软件 和单细胞去条形码工具对数据进行标准化和去条形码处理，如前所述。然后将数据上传到 CellEngine 进行分析。

2.6  统计数据

统计方法在正文和图例中都有描述。箱线图，中心线表示平均值；箱线的下限和上限分别表示下四分位数和上四分位数；晶须表示 1.5 x 四分位距。使用单尾 Mann-Whitney U 检验进行对间检验，使用方差分析进行组间检验，并对多个假设进行 Bonferroni 校正。小于 5x10 -2 的p 值被认为是显著的。 *p < 5x10 ^-2 , **p < 1x10 ^-2 , ***p < 1x10 ^-3。

3 结果

3.1  建立抗体反应性筛选

为了创建通用的跨物种质谱流式细胞术面板，我们首先进行了全面的流式细胞术抗体交叉反应性筛选，以确定合适的克隆。为了确定一组单克隆抗体在不同物种间的免疫细胞类型特异性反应性，我们设计了一套复染抗体的流式细胞术面板，该面板描绘了人类、食蟹猴、恒河猴、非洲绿猴和狒狒血液中的主要循环免疫细胞类型（图 S1A）。我们策略性地选择了复染抗体的荧光团，以保持用于筛选抗体的 PE 通道无补偿，从而避免技术伪影。该面板可轻松识别粒细胞、B 细胞、T 细胞、NK 细胞和单核细胞/树突状细胞。在除非洲绿猴以外的所有物种中，我们可以根据 CD11b 表达额外分离单核细胞和树突状细胞。在非洲绿猴中，CD11b (ICRF44) 不反应，我们选择不包括替代标记以保持所有物种的技术一致性。在测试了许多旨在保持抗原染色和有效裂解非人类灵长类动物血液的方案（未显示数据）后，选择了固定和红细胞裂解条件。用 0.26% 多聚甲醛 (PFA) 固定足够低以避免明显的染色损失，并且足以最大限度地减少细胞的形态变化，如在流式细胞仪上采集过程中观察到的前向和侧向散射信号的变化。使用 VersaLyse 进行酶促裂解对人类和 NHP 血液都非常有效，而其他方法（如低渗裂解）对 NHP 血液不充分或不一致。

图 1研究示意图。

说明：(A)通过流式细胞术对 5 个不同物种的 332 个抗体克隆进行测试，以识别交叉反应克隆。(B)使用通用质谱流式细胞术抗体组对来自 5 个不同物种并受到 15 种不同刺激的全血样本进行分析，该抗体组能够识别 12 种不同的细胞类型。

在这些处理条件下，我们对人类和 NHP 的新鲜全血样本（总共 n=9，每个 NHP 物种 n=2 个生物学重复，n=1 个人类对照）进行了流式细胞术筛选，分别测试了 332 个抗体克隆。如果超过 10% 的细胞的 PE 信号强度大于同一物种和种群相应同型对照强度的第 95 个百分位数，则抗体克隆最初被归类为与种群具有反应性。发现该阈值准确反映了人工检查的结果：我们验证了 14,940 个克隆 x 物种 x 种群结果中的500个，同时考虑到报告的染色模式和与同型对照的视觉分离程度，并计算出假阳性率为 7.4%，假阴性率为 1.6%，我们数据的初始准确率为 91%。然后，我们手动验证并根据需要纠正所有不一致的重复和所有在非人类灵长类动物中被归类为反应性但在人类中不反应的克隆；因此，我们最终的估计准确率超过 91%。总共，我们分别鉴定出 259、148、125、159 和 147 个与人类、食蟹猴、恒河猴、非洲绿猴和狒狒中的一个或多个种群有反应的克隆（表 S1）。该筛选的所有数据均公开，可供研究人员独立验证跨物种克隆的反应性（https://flowrepository.org/id/FR-FCM-Z2Z7）。

3.2筛选揭示的物种间表达模式差异的显著例子

与人类不同，恒河猴的 CD33 存在于粒细胞中，而 CD16 仅限于单核细胞和树突状细胞。在本研究中，我们发现非洲绿猴与恒河猴具有相同的染色模式，尽管 CD33 染色较弱。另一个显着的区别（在观察到的众多特质表达模式中）是 CD172g（信号调节蛋白 (SIRP) γ，也称为 SIRPβ2）在 CD11b+ 单核细胞和粒细胞上表达，但不在 T 细胞上表达，在所有检测的 NHP 物种中都是如此。相比之下，人类的这种标记物在 T 细胞、一些 B 细胞和一定程度的粒细胞中表达。由于缺乏胞质信号结构域，CD172g 推测通过激活表达 CD47 的细胞并诱导人类、小鼠和大鼠中的 T 细胞迁移和增殖来单向发出信号。因此，我们的发现表明在免疫细胞迁移和适应性反应的调节方面存在重大差异，值得进一步研究。

发现差异的另一个显著例子是 CD2 染色不仅存在于 T 细胞上，还存在于恒河猴、食蟹猴、非洲绿猴和狒狒的 B 细胞上（图 S1C）。

CD2 参与粘附、共刺激、抗原识别和潜在分化。在小鼠中，几乎所有循环和骨髓 B 细胞都表达 CD2。Kingma 等人之前报道，一小部分（3.6±1.6%）正常人类外周血 B 细胞表达 CD2，但我们在人类对照中没有观察到 CD2+ B 细胞，这可能是由于研究之间供体或克隆特异性差异造成的。因此，B 细胞 CD2 表达似乎在进化过程中下降，在最古老的物种（小鼠）中表达最丰富，在恒河猴和非洲绿猴中表达中等，在狒狒中表达较少，在最年轻的物种（人类）中基本上没有表达。有趣的是，CD2 的配体在物种之间并不保守：在小鼠和大鼠中，CD2 仅与 CD48 结合，而在人类中，它与 CD58 强结合，而与 CD48 仅弱结合，CD48 也与 CD58 共同表达。

3.3CyTOF 面板设计

我们利用抗体筛选的结果以及几个有针对性的后续实验的结果，为恒河猴、食蟹猴、非洲绿猴和人类制作了一组平行的 CyTOF 质谱流式细胞术细胞表型分析面板（表 S2）。只要有可能，我们对所有物种使用相同的抗体克隆。对于红细胞，我们对人类使用了常见标记 CD235a，对 NHP 使用了 CD233，而不是对所有物种都使用不太常见的 CD233（找不到与 NHP 反应的抗 CD235 克隆）。对于 CD11c，用于人类的 Bu15 克隆在 NHP 中不反应，因此使用克隆 3.9 代替。然而，据报道克隆 3.9 优先结合活化的 CD11c，并需要在染色过程中添加镁作为辅因子（ 32、33 ）。因此，为了保持一致性，我们在门控分析中主要使用 CD16 代替 CD11c。在幼稚和记忆性 T 细胞中，我们观察到 CD45RA 染色分布非常广泛，如之前报道的有两个克隆（5H9 和 HI100），很难进行门控（参见在线数据集）。使用基于 VersaLyse 的方法对该标记物的染色效果优于使用基于 Triton-X100 的方法（未显示数据）。

通常，非洲绿猴可以使用与恒河猴相同的克隆，但有几个例外（表 S2）。未发现 CD11c 的反应性克隆；相反，我们再次依靠 CD16 来门控单核细胞亚群，依靠 CD123、CD1c 和 BDCA3 来门控树突状细胞亚群。此外，利用之前研究中已建立的克隆，我们为小鼠创建了一个类似的面板，该面板描绘了与灵长类面板中针对的相同群体，从而能够对所有五个物种进行并行门控。

设计了信号抗体组，用于为跨物种表型组识别的细胞类型提供细胞信号读数。信号表位高度保守，除一个例外，相同的抗体克隆可用于所有五个物种。

我们采取了许多措施来减少错误和技术变异性（见材料和方法）。这些 CyTOF 组经过彻底滴定以确定每种抗体的最佳染色浓度，然后在每个物种的至少两名供体中重新验证。抗体是批量偶联的，我们随后与 BioLyph LLC 签订了合同，将这些组的数千个一次性颗粒（“LyoSpheres”）冻干并包装，以确保稳定性并消除反复组装鸡尾酒造成的移液错误。

3.4表型分析、刺激和信号传导分析

为了绘制不同物种之间免疫表型和信号反应的相似性和差异性，我们对 86 名健康人、32 只恒河猴、32 只食蟹猴、24 只非洲绿猴和 50 只 C57BL/6 小鼠的新鲜全血进行了检测，并在体外用 15 种不同的治疗方法进行刺激（图 1B和表 S5列出了刺激物）。选择刺激物和读数是基于它们的临床相关性及其在疾病和先天免疫中的作用。许多刺激物是重组细胞因子。这些重组蛋白最好是物种匹配的；即在恒河猴血液中使用重组恒河猴细胞因子。如果没有找到合适的蛋白质，我们会使用最接近的物种（例如，在非洲绿猴血液中经常使用恒河猴细胞因子）。由于缺乏非人类灵长类动物细胞因子的标准测定和参考试剂，无法在不同物种间使用相同数量的功能单元，因此我们改为使用浓度超过 EC50 值的相同质量的试剂，从而将细胞因子效力/活性变化对测定的影响降至最低。同样，为了最大限度地减少技术变异性和错误，刺激物尽可能预先分配到一次性板中。使用新鲜全血代替 PBMC，以避免密度梯度分离和储存带来的干扰和不一致。我们使用质量标签条形码将所有刺激条件的染色合并到每个供体的一个管中，消除了染色量和处理的差异。刺激、固定、裂解、条形码和染色均采用完全自动化。在每次取样前进行 CyTOF 质量控制测试，并包括内部标准化标准以控制运行期间的变异性。最后，所有分析代码都已在 Wolfram 语言笔记本中注释，可根据要求提供，同时还提供抗体结合和样品处理的详细记录。

3.5细胞类型频率因物种而异并重现进化树

使用图 S2中所示的层次结构，我们对所有物种的血细胞进行并行门控，以确定这些细胞类型的频率分布。请注意，这些层次结构仅显示主要群体，并使用我们表型分析面板的子集。可以进一步对大多数这些群体进行子集划分 - 例如，NK 细胞可以基于 CD20、CCR7 和 CD56 进一步进行子集划分 - 我们希望感兴趣的研究人员能够探索https://flowrepository.org（accession  FR-FCM-Z2ZY）上的数据。许多细胞群的频率在不同物种之间存在显著差异；显着的差异包括（a）猕猴比人类、小鼠或 AGM 具有更多的 CD4 + / CD8 + 双阳性 T 细胞，（b）小鼠的中性粒细胞比所有灵长类动物少约 10 倍，（c）所有非人类灵长类动物的 B 细胞比人类多约 3 倍，小鼠的 B 细胞比人类多约 10 倍，（d）人类的经典单核细胞与非经典单核细胞的比例高于任何其他物种（图 2）。

图 2

说明：不同物种门控细胞类型的频率（占总数的百分比）。中心线：中位数；方框：第 25 至第 75 分位数；晶须：1.5x 四分位距。统计：对每个种群计算了 Bonferroni 后检验的方差分析。星号表示与人类有显著差异的物种 *p < 5x10 -2，**p < 1x10 -2，***p < 1x10 -3（Bonferroni 校正后）。

当我们根据物种平均细胞类型频率之间的相关性对其进行聚类时，我们重现了进化树（图 3，右图）：恒河猴和食蟹猴最近分化，距今 150 万至 350 万年前（Ma）；恒河猴和非洲绿猴分化时间为 1150 万至 1400 万年前；旧世界猴和人类分化时间为 2000 万至 3800 万年前，小鼠分化时间为 9000 多万年前（36 – 38）。这一结果为未来分析大量物种以寻找免疫系统进化的关键时刻提出了一个有趣的可能性。

图 3

说明:根据细胞类型频率对物种进行聚类，重现了进化树。计算了每个物种中 10 种细胞类型（中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B 细胞、CD8+ T 细胞、CD4+ T 细胞、CD4+/CD8+ T 细胞、pDC、NK 细胞、经典单核细胞和非经典单核细胞）的平均频率，然后根据物种之间的成对相关性进行聚类（右）。这种主要的聚类顺序保留在更大的热图（左）中，其中显示了每个个体供体，并根据其个体细胞类型频率进行聚类。

在保持这一主要聚类顺序的同时，我们随后根据细胞类型频率对物种内的个体供体进行亚聚类（图 3）（请注意，由于容量有限，50 只小鼠的血液被汇集到六个试管中，按性别分开）。物种内聚类之间的距离最小的是小鼠，其次是非人类灵长类动物，然后是人类。考虑到小鼠是单一近交系，非人类灵长类动物是从孤立的群落中捕获的野生动物或圈养繁殖的，而人类是专门招募的，包括各种种族，这并不奇怪。在大多数情况下，一个物种内的所有个体与其他物种都有相似的相关性；尽管如此，一些非人类灵长类动物比其他灵长类动物与人类更相似。重要的是，聚类与处理个体的批次无关；也就是说，批次效应不是这种聚类的驱动因素（未显示数据）。

3.6  不同物种的直系同源细胞类型具有独特的表型

为了评估不同物种间直系同源细胞群表型的潜在差异，我们绘制了每个物种按群落划分的每个表面标志的染色强度分布图，并将这些数据作为未来研究的参考。虽然这些群体在不同物种中表达许多相同的标志，但定性分析发现了许多潜在差异。例如，与所有三种 NHP 物种相比，人类的中性粒细胞表达高水平的 CD16 和中等水平的 CD11c；同时，三种 NHP 物种中的中性粒细胞表达更高水平的 CCR7，小鼠的中性粒细胞表达中等水平的 CD16/32。恒河猴的 B 细胞表达的 CD1c 水平高于人类或非洲绿猴，如后面所述。人类的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞表达的 CD161 和 CD7 水平高于 NHP，而小鼠 T 细胞不表达 NK1.1（CD161）。 NHP 中的 NK 细胞表达的 CD8 水平高于人类；这与 Autissier 等人的观点一致，尽管我们不能忽视一些人类 NK 细胞也表达 CD8 的事实。非洲绿猴中的经典单核细胞对 BDCA3 染色明亮，这是人类的典型树突状细胞亚群标记。

图 4

说明：中性粒细胞中各物种表面标志物表达的分布。（其他种群见图 S3）。如果不同标志物位于同一通道上，且对物种间相似的细胞类型进行染色，则将其归为一组（例如 CD235a/CD233/Ter119 均位于 In113 上，并染色红细胞），

并标记为“[所有物种]”、“[灵长类动物]/[小鼠]”或“[人类]/[非人类灵长类动物]/[小鼠]”。

应谨慎解释染色强度的差异，因为抗原的基因组变异可能会影响物种之间的结合亲和力。还必须考虑到 NHP 与人类不同表位和种群的交叉反应存在差异的可能性，而大多数灵长类动物抗体都是针对人类产生的。出于这个原因，我们主要关注标记在一个或多个物种中存在而在另一个物种中基本不存在的情况，或者我们可以通过进一步的数据挖掘和文献综述来证实的情况。

3.7物种特异性信号传导特征对药物开发具有重要意义

为了研究直系同源细胞类型的功能差异，我们将不同物种的信号传导行为可视化。这些图表旨在提供紧凑的半定量概述，作为未来研究的参考点；表 S8、S9提供了按供体和人群提供的标记中位数完整表格。重要的是要认识到，由于该数据集很大，单个细胞信号传导观察结果需要在后续研究中进行验证，以完全排除错误发现。尽管如此，我们在这里和后续章节中探讨了信号传导行为的许多潜在差异以及它们与现有文献的关系。在先天免疫反应方面，我们观察到小鼠经典单核细胞中明显缺乏 TLR7/8（R848）和 TLR4（LPS）反应，证据是缺乏 pTBK1、pP38 和 pMAPKAPK2 信号。 TLR7/8 (R848) 的结果并不意外，因为先前的文献表明小鼠 TLR8 有缺陷，而 TLR7 主要在树突状细胞 (DC) 中表达（与此一致，我们看到小鼠 pDC 对 R848 有反应）。小鼠单核细胞缺乏 TLR4 信号传导是一个潜在的新观察结果；先前的文献中尚不清楚小鼠血液单核细胞在基础条件下 TLR4 的表达和功能，但已知与人类有显著差异 。考虑到这些发现，再加上小鼠单核细胞基本上缺乏 MHC-II，因此不是主要的抗原呈递细胞 ，很明显，对人类先天免疫反应至关重要的经典单核细胞在小鼠中可能发挥着非常不同的作用。

图 5

说明：刺激物、激活标记物和物种（图 S4中的其他细胞类型）对经典单核细胞的信号反应（ArcSinh 转换值的差异；大约相当于倍数变化）。请注意，炭疽芽孢杆菌（“炭疽”）和埃博拉病毒样颗粒不能用作小鼠或 AGM 中的刺激物；因此，这些物种的值始终显示为零。我们无法对小鼠中的中间单核细胞或“CD11b−/CD16−”当量群体进行门控；这些值也为零。所有图表的 Y 轴范围为 -0.5 至 +1.5。

我们还观察到，所有三种 NHP 物种似乎对非经典单核细胞中的 IL-4 几乎没有 pSTAT6 反应。这与人类和小鼠形成了鲜明对比，在人类和小鼠中，pSTAT6 对 IL-4 的反应是一种主要的典型信号反应。已知缺乏 STAT6 的小鼠在对整个范围内的 IL-4 的反应中表现出有缺陷的免疫行为。尽管非经典单核细胞几乎没有反应，但所有三种 NHP 物种似乎对其他细胞类型中的 IL-4都有不同程度的 pSTAT6 反应，包括 T 细胞、经典单核细胞、中间单核细胞、中性粒细胞、B 细胞、DC 和 NK 细胞。在我们的测定中，这些反应可作为 NHP 中 STAT6 和 IL-4 的阳性技术对照，但也可能指向 NHP 中非经典单核细胞缺乏反应的生物补偿。

最后，我们观察到非洲绿猴 pDC 似乎对 R848 基本上没有 IκBα 反应，尽管它们的 pTBK1 反应比任何其他测试物种都强。同时，猕猴 pDC 可能对 IL-6 具有独特的 pSTAT5 反应。其他人报告说，IL-6 导致小鼠 T 细胞和 NK 细胞中 STAT5 的低水平磷酸化在 15 分钟内达到可检测水平（我们使用的时间点）；我们也看到小鼠和人类在这些细胞类型中出现了轻微的反应，但这些反应的幅度与猕猴 pDC 相比相形见绌。

这些结果强调了谨慎选择和解读动物模型以进行药物开发和评估的重要性，因为物种间巨大的信号差异可能会在细胞水平的药物反应方面产生误导性结果。本报告的其余部分详细介绍了物种间在 B 细胞、T 细胞、粒细胞和单核细胞方面可能存在差异的几个具体例子，特别关注了猕猴独有的几种细胞类型和行为。

3.8  猕猴单核细胞丰度与猴疱疹 B 病毒状态相关

许多猕猴通过自然接触感染了猴疱疹 B 病毒（以前称为猴疱疹病毒 1，或 B 病毒）。与人类的单纯疱疹病毒一样，该病毒是社区或性传播的，可终生存在，对猕猴基本无害。疱疹血清状态是否会影响一般免疫健康尚不清楚，大量已发表的猕猴研究未报告动物的血清状态或报告使用 SPF 动物。

我们发现，在所有恒河猴中，B 病毒状态与非经典单核细胞丰度之间存在显著关联，而在恒河猴中，与中间和非经典单核细胞频率的关联更强。这一发现表明，猴疱疹 B 病毒血清状态确实会影响免疫功能，因此可能影响在恒河猴治疗评估期间观察到的先天免疫反应。

图 6 

说明：（A）恒河猴和食蟹猴或（B）恒河猴中细胞类型的频率，按疱疹 B 病毒状态划分。使用单尾 Mann-Whitney U 检验计算血清状态组之间的 P 值。

恒河猴体内 CD4+CD8+ 双阳性 T 细胞更为丰富，已知恒河猴外周 CD4+CD8+ 双阳性 (DP) T 细胞的频率高于人类，并且其频率随着年龄的增长而增加 (图 S5 )。我们发现恒河猴的中位频率为 5.3%，食蟹猴为 1.4%，AGM、小鼠和人类的中位频率不到 0.2% (图 S5 )。

3.9 猕猴粒细胞对炭疽杆菌有快速反应

我们评估了 22 × 10 ⁶ CFU 经伽马射线照射（灭活）的炭疽芽孢杆菌Ames 菌在 15 分钟的孵育过程中的信号反应。尽管孵育时间很短，但我们发现恒河猴的中性粒细胞活化水平（Ki67）比人类略高，但显著高于人类（图 7A）。这表明这些动物对感染的反应非常迅速；人类可能完全没有这种反应，或者动力学延迟。

图 7 

说明：(A)暴露于 22M CFU 伽马射线照射的炭疽杆菌15 分钟后，不同物种的中性粒细胞 Ki67 诱导（ArcSinh 转换值差异的平均值和标准误差）。(B) CD1c+ B 细胞在非人类灵长类动物中比在人类中更丰富，而且 CD1c 在 NHP B 细胞中的表达水平更高，尤其是在猕猴中。 左图：每个物种中 CD1c+ B 细胞的丰度（以占总 B 细胞的百分比表示）。 中间和右边：每个物种的一个代表性个体。 点图显示 500 个随机选择的 B 细胞（中间）或 250 个随机选择的 CD11b-/CD16- DC（右）。统计数据(A、B)：使用单尾 Mann-Whitney U 检验对组间进行比较，其中星号表示存在显著差异 (*p < 5x10 -2 , **p < 1x10 -2 , ***p < 1x10 -3 )。这种激活发生在中性粒细胞中尤其有趣，不仅因为中性粒细胞可以杀死炭疽杆菌，还因为猕猴和其他几种 NHP 物种的中性粒细胞独特地含有 θ 防御素，这是一种对抗炭疽杆菌及其致死因子 (LF) 的强效抗生素。这一发现尤其重要，因为炭疽疗法是动物规则下评估的候选药物之一，疗效研究是在动物模型中进行的。由于我们无法控制的原因（国防部实验室程序综合审查委员会，2015 年），我们在项目中途停止使用芽孢杆菌抗原；因此，没有一个小鼠或 AGM 样本用芽孢杆菌抗原处理，也没有 18 个人类样本用芽孢杆菌抗原处理。因此，我们的分析仅考虑了经过处理的样本。

3.10猕猴具有独特的 CD1c+ 和 CD8+ B 细胞亚群

我们在恒河猴中观察到两种独特的 B 细胞亚群，它们由 CD1c 或 CD8α 表达定义。这些细胞群在人类、小鼠和非洲绿猴中非常稀少或不存在。

CD1 是一个脂质和糖脂呈递分子家族，是 B 细胞和树突状细胞亚群中发现的 MHC I 类和 II 类分子的对应物，在人类防御结核病等疾病方面发挥着重要作用。CD1c (BDCA-1) 特异性呈递甘露糖基肌酮肽和磷酸肌酮肽 。先前的研究报告称，恒河猴的 B 细胞中有 21.4% 是 CD1c+ B 细胞，而人类只有 3.3% 。同样，我们在所检测的所有三种 NHP 物种中都发现与人类相比，CD1c+ B 细胞明显更多，其中 CD1c 的含量也明显更高。有趣的是，小鼠和大鼠完全缺乏第 1 组 CD1。小鼠对结核病的敏感性因菌株而异，但至少有几种菌株，包括常见的 C57BL/6 和 BALB/c 菌株，具有抗性，因此必须具有第 1 组 CD1 独立的感染控制机制。关于 CD1c 染色强度较高，我们最初认为这可能是由于物种间抗体亲和力的差异所致；然而，恒河猴和人类的树突状细胞上的 CD1c 水平相似。

在人类中，CD8α 几乎只存在于 T 细胞和 NK 细胞亚群中；例外仅限于 HIV-1 、B 细胞白血病和淋巴瘤等疾病，以及健康个体中可能存在的非常小的亚群 。然而，在许多恒河猴中，CD8α 也存在于 B 细胞亚群中 。我们发现 25 只动物中有 19 只至少有 0.5% 的 B 细胞被 CD8 染色，一些动物有多达 33% 的 B 细胞被染色（平均值：6.5%，中位数：3.3%）(图 S6A )。我们将这些细胞设为 CD45+ CD66- CD3- CD20+ CD7- CD8+，从而排除 T 细胞和 NK 细胞，因为它们在恒河猴中也会被 CD8 染色。我们继续确定，猕猴、非洲绿猴和小鼠似乎没有 CD8+ B 细胞。由于我们同时测量了表型和信号分子，因此我们还能够评估 CD8+ B 细胞的功能行为。考虑到几个更高强度的反应，我们发现这些细胞仍然表现出 CD8- B 细胞的标志性信号行为，尽管可能具有更强的 pSTAT1 信号传导。

因此，这些发现可能是重要的标准，不仅可以选择用于模型开发和治疗评估的物种，而且考虑到恒河猴体内 CD8 + B 细胞频率的巨大差异，哪些个体捐赠者。

4   讨论

动物模型在药物开发中很常见，但它们并不完美，可能会导致误导性的假阳性结果（药物在模型中有效但在人类身上无效）和假阴性结果（药物在模型中无效但在人类身上有效）。除了经济和道德负担之外，这还会造成公共卫生问题，因为它会削弱研究人员开发新发疾病的治疗方法和对策的能力。为了成功开发影响特定途径和细胞类型（而不是广泛激活免疫系统或传染源本身）的下一代靶向疗法，需要仔细选择相关模型。为了实现这一目标，我们创建了人类、小鼠和非人类灵长类动物之间免疫学差异的综合图谱。

为了构建该图谱，我们首先大幅扩展了灵长类动物之间可用的抗体交叉反应数据的广度和深度，并在线存储了包含主要流式细胞术文件的交叉反应数据集，以便任何用户都可以轻松比较这些物种的染色模式，甚至查看细胞亚群来检查特异性 - 这些信息通常不会在 NIH 数据库（nhpreagents.org）中报告。

通过评估特定细胞类型，我们发现许多抗体对非人类灵长类动物和人类的不同群体进行染色。鉴于此，研究人员应采取适当措施，确保在使用这些试剂时以及在评估针对这些蛋白质的免疫疗法时评估目标群体。

虽然我们筛选了 332 种不同的抗人抗体克隆，但这些抗体所针对的抗原并非全部都存在于我们测试的静息外周血细胞中。事实上，只有 78.3% (260/332) 的抗体对人血呈阳性染色。因此，我们的筛选没有评估仅在骨髓和其他组织细胞、祖细胞或活化群体中发现的标记物。此外，染色稀有群体的抗体——尤其是占我们划定的群体之一的不到 10% 的群体，或表现出微弱表达的抗体，这些抗体可能被我们应用的表达和染色阈值排除在外。我们鼓励在解释 CD41 和 CD51/CD61 等标记物时要谨慎，这些标记物被列为与所有细胞类型反应，但实际上，根据这些标记物在人类中的已知分布，它们可能染色粘附在其他细胞上的血小板碎片。还需要记住的是，由于基因序列、蛋白质结构和翻译后修饰的差异，实际的抗体-抗原特异性可能因物种而异。

这里描述的交叉反应数据对于非洲绿猴 (AGM) 免疫学的发展尤其有价值，因为关于免疫表型的文献很少，NIH 数据库中仅列出了 28 种反应性抗体。尽管如此，该物种在药物开发（尤其是 SIV 研究）中很重要，并且是国际努力的主题，旨在使其成为表型和基因组学特征最全面的 NHP 。值得注意的是，由于用于研究的恒河猴短缺，AGM 的使用量正在增加。

在本文介绍的细胞表型分析中，我们重点关注物种间高置信度差异。由于特定原因，我们没有讨论几个观察到的潜在差异：（a）虽然人类 NK 细胞、B 细胞和非经典单核细胞似乎表达更高量的 CD45RA，但我们之前观察到 NHP 和人类对这种克隆的亲和力可能存在差异。（b）由于人类用抗 CD19 染色，而 NHP 用抗 CD20 染色，我们不能必然得出结论说这些 B 细胞标记物的染色差异有显著不同。（c）如前所述，虽然已知 AGM 中存在 CD11c，但找不到与 AGM 交叉反应且对我们的 CyTOF 面板足够敏感的 CD11c 克隆。因此，该标记在 AGM 的所有群体中均为阴性。 (d) CD61 的中等、广泛染色（通常染色血小板、单核细胞和巨噬细胞）可能是由于血小板碎片在加工过程中粘附到其他细胞类型上，因此生理意义不大。然而，也有人提出这种标记物是由来自血小板衍生微泡的活化 T 细胞获得的，并且在之前对猕猴血液的研究中，我们观察到 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞的亚群染色 CD61（未显示），这可能表明这不仅仅是猕猴 T 细胞中的活化标记物。

在对信号传导分析做出精确的定量结论之前，还必须考虑与剂量和细胞因子活性相关的必要技术注意事项：如果可用，我们会使用针对每种物种的细胞因子，并且我们以与人类相同的质量浓度（即 mg/mL）给药，而不是试图协调物种特定的 ECx 值。因此，定量比较必须通过仔细检查对照和/或进行剂量反应曲线等其他实验来验证。为此，我们建议与数据集中的其他信号传导抗体、刺激条件和/或其他细胞类型进行比较，这些通常可以作为内部对照。此外，由于该数据集的规模非常大，并且可能出现错误发现，因此在后续研究中进行验证之前，应谨慎对待单个细胞信号传导观察结果。

本文的补充材料可在线找到：https: //www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.867015/full#supplementary-material补充材料

附录一

补充图 1 | (A)五种复染剂可识别至少五种细胞群。

图中显示了狒狒的代表性染色。通过时间门控排除伪影后，粒细胞被鉴定为 CD66abce+/SSC-A+。非粒细胞分为 B 细胞 (CD20+/CD3−)、T 细胞 (CD3+/CD20−)、NK 细胞 (CD7+/CD3−/CD20−) 和单核细胞/树突状细胞 (CD7−/CD3−/CD20−)。*在非洲绿猴以外的物种中，可根据 CD11b 染色分离树突状细胞。(B)在所检测的 NHP 物种中，CD172g 在单核细胞和所有粒细胞上表达，但不在 T 细胞上表达。相比之下，CD172g 在人类的所有 T 细胞、粒细胞亚群和 B 细胞亚群上表达（数据未显示）。如文中所述，CD11b 不会均匀地染色 AGM；因此，一些 CD11b 阴性细胞是单核细胞。蓝色：同种型对照，橙色：CD172g。（C） CD2 在 NHP 的 B 细胞上表达。蓝色：CD3+ T 细胞，预计在人类中表达；橙色：CD20+ B 细胞。

补充图 2 |通用表型分析面板能够对人类、猕猴、非洲绿猴和小鼠进行平行门控。

补充图 3（略） |图 4的延续：所有细胞类型中每个物种的表面标志表达的分布。

补充图 4（略） |图 5的延续：所有细胞类型受刺激、激活标记和物种的信号传导反应。

补充图 5 |恒河猴和食蟹猴 CD4+CD8+ 双阳性 T 细胞的频率分布。表：按物种划分的中位频率（单细胞百分比）。

补充图 6 | (A)恒河猴中 B 细胞 CD8 染色百分比的直方图。

群体定义为 CD45+ CD66- CD3- CD20+ CD7- CD8+。(B)每种物种代表性动物的 B 细胞和 T 细胞 CD8 染色。(C)具有 CD8+ B 细胞的恒河猴的选定平均信号反应。细胞 (1) 仍通过磷酸化 CREB 和降解 IκBα 对典型 B 细胞刺激 CD40L 作出反应，尽管程度低于 CD8- B 细胞；(2) 与 T 细胞和 NK 细胞不同，不会因 TNFα 而降解 IκBα，不会因 IL-2 而磷酸化 STAT5，也不会因 IFNβ 而磷酸化 STAT4；(3) 对 IFNβ 的 pSTAT1 反应比 CD8-B 细胞高 47%。

附录二

补充表 1（节选） |细胞类型特异性交叉反应性总结

补充表 2 | CyTOF 面板。表 1-3：人类（表 1）、猕猴（表 2）、AGM（表 3）和小鼠（表 4）的细胞外抗体、克隆、标签和染色浓度。表 5：信号传导和其他后透化抗体。*在补水时，每 12 个 LyoSpheres 表面混合物补充 8.64 µl CD4 #201 (OKT4) 以增加信号。

human

Macaque

AGM

mice

胞内

补充表 3（略） |报告恒河猴 DP T 细胞频率的研究。 

补充表 4（略） |人类捐赠者的人口统计数据。39 名女性和 44 名人类捐赠者信息。

补充表 5 |刺激物。标有星号 (*) 的刺激物在使用时由于生产和/或储存要求而被分配。

表 5 |刺激物

补充表 6（略） |所有灵长类动物样本的 13 个种群的种群数量和频率。

补充表 7（略） |所有小鼠样本的 10 个种群的种群计数和频率。

补充表 8（略） |所有灵长类动物样本的 13 个群体的功能标记（例如磷酸化特异性抗体）中值。

补充表 9（略） |所有小鼠样本的 10 个群体的功能标记（例如磷酸化特异性抗体）中值。