三种动物麻醉剂对C57BL/6J小鼠麻醉效果及血清生化指标的影响

刘军  丁登峰   高伟   贾云晓   赵常琦   牛苗苗

(中国人民解放军总医院医学创新研究部实骏动物中心,北京100853)

摘 要:目的 比较三种动物麻醉剂三溴乙醇、戊巴比妥钠、舒泰50联合盐酸塞拉嗪的麻醉效果及对小鼠血清生化指标的影响,探索三种麻醉剂麻醉 C57BL/6J(B6)小鼠的合适剂量范围。方法 采用健康SPF级雄性 B6小鼠100只随机分为10组,每组10只,三种麻醉剂分别以高、中、低剂量梯度对B6小鼠进行腹腔注射,比较三种麻醉剂不同剂量的麻醉诱导时间、维持时间、恢复时间及对B6小鼠血清ALT、AST、CLU和UA指标的影响。结果 三种麻醉剂的麻醉维持时间和恢复时间与剂量呈正比,诱导时间与剂量呈反比。中(250mg/kg)低(125 mg/kg)剂量三溴乙醇(1.25%),中(80 mg/kg)低(40 mg/kg)剂量戊巴比妥钠(1.0%)及中(60 mg/kg)低(30 mg/kg)剂量舒泰 50(0.50%)联合盐酸塞拉嗪(0.50%,中剂量12 mg/kg、低剂量6mg/kg)对 B6小鼠的麻醉相关时间较为适中,对肝肾功能影响较小。结论 三种麻醉剂的不同剂量对B6小鼠的麻醉时间效果和血清生化指标的影响不尽相同:三溴乙醇在125-250mg/kg范围内麻醉效果较好;戊巴比妥钠在40-80mg/kg范围内麻醉效果较好;舒泰50联合盐酸塞拉嗪在 30~60 mg/kg(盐酸塞拉嗪6~12 mg/kg)范围内麻醉效果较好;在涉及 ALT、AST、GLU 和 UA 的研究过程中,需根据不同实验需求选择合适剂量的麻醉剂。

关键词:麻醉剂:小鼠:三溴乙醇;戊巴比妥钠:舒泰;盐酸塞拉嗪;生化指标

中图分类号:095-3 文献标志码:A  文章编号:1006-6179(2024)02-0051-08 D0I:10.3969/j.issn.1006-6179.2024.02.009

小鼠是继人类之后第二个完成基因测序工程的哺乳动物,它和人类的基因组各有约3万个基因,其中约99%的基因相互对应,且具有高度同源性^[1-2]。小鼠具有繁殖能力强,饲养管理方便,体型小,生产成本较低,易于管理和实验操作,其质量标准明确等优点,是广泛应用于人类疾病研究的实验动物模型。良好的麻醉效果可以有效地保障动物实验的顺利进行,以及实验结果的真实性和可靠性。戊巴比妥钠是经典的实验动物麻醉药,三溴乙醇和舒泰联合盐酸塞拉嗪近几年来也广泛用于小动物临床和实验室实验的麻醉,然而其不同浓度、不同剂量对不同品系小鼠的麻醉效果有待进一步研究。本文通过比较戊巴比妥钠、三溴乙醇和舒泰联合盐酸塞拉嗪这三种麻醉剂对B6小鼠的麻醉效果和对血清生化指标的影响,分析使用不同麻醉剂不同剂量在小鼠造模和外科手术中的应用价值,旨在为这三种麻醉剂在B6小鼠的有效应用提供参考依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1 实验动物:使用SPF级B6，雄性,10周龄，体质量22-25g的小鼠100只,购自斯贝福生物技术有限公司,生产许可证号为SCXK(京)2019-0010。这些小鼠饲养在解放军总医院实验动物中心的屏障系统内,使用许可证号为SYXK(军)2017-0019,自由饮食和饮水,室温22-24℃,相对湿度在40%-60%.12h/12h昼夜间断照明。该研究方案已由解放军总医院实验动物伦理委员会批准，伦理审批号为2022-x18-130,实验实施过程中严格遵守其指导原则。

1.1.2 主要试剂及仪器:戊巴比妥钠粉末(Sigma公司,批号:69020100)；三溴乙醇(北京莱艾特科技发展有限公司，批号:LAT 20230331);舒泰(Zoletil® 50)(维克公司,批号:8SFVA),盐酸塞拉嗪注射液(吉林省华牧动物保健品有限公司,批号170521);0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司,批号:2205093602):全自动生化分析仪和配套试剂(东芝公司,型号:TBA2000F)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组:100只B6小鼠稳定2周后随机分为10组,每组10只。根据参考文献、预实验的初步探索及试剂厂商提供的参考剂量,确定1%戊巴比妥钠(WB)1.25%三溴乙醇(SXYC)和0.50%舒泰50联合0.50%盐酸塞拉嗪【SS:舒泰50和盐酸塞拉嗪都稀释到5mg/mL后按5(舒泰50):1(盐酸塞拉嗪)的体积进行混匀】这三种麻醉剂的低(L)、中(M)、高(H)剂量的麻醉使用量,见表1。麻醉前称取小鼠的体质量并计算麻醉剂的用量进行腹腔注射。对照组(CON)小鼠腹腔注射300μL的0.9%的氯化钠注射液。待麻醉小鼠翻正反射消失后,将小鼠放于保温垫上,观察并记录小鼠的麻醉诱导时间、维持时间和恢复时间。

1.2.2观测指标:常规观测指标是指在整个麻醉期间需要密切观察小鼠的呼吸、心跳和体温等生命体征变化,肢体运动状态、四肢步态、胡须触碰反应、流涎、肌肉松弛震颤状态等行为学的变化,记录各组的小鼠死亡率^[5]。时间相关麻醉检测指标:麻醉诱导时间指麻醉药物注射小鼠体内到小鼠倒下并丧失痛觉的时间;麻醉维持时间是指小鼠痛觉丧失到小鼠角觉恢复的时间;麻醉恢复时间是指小鼠痛觉恢复到小鼠自行翻正的时间;总麻醉时间=麻醉诱导时司+麻醉维持时间+麻醉恢复时间。痛觉丧失的判断的标准:小鼠全身肌肉松弛,呼吸平顺,使用镊子按压小鼠后肢足趾末端,小鼠无疼痛反应。痛觉恢复的判断标准:小鼠呼吸速度加快,使用镊子按压小鼠后肢足趾末端,小鼠有疼痛反应。

1.2.3 血清生化指标检测:待小鼠麻醉苏醒后再饲养12h,通过摘眼球取全血400~600μL.3000r/min离心10 min后吸取血清,采用东芝 TBA2000F全自动生化分析检测肝、肾功能及血糖等,包括丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、葡萄糖(GLU)和尿酸(UA)的血清含量。

1.3 统计学分析

计量资料采用均数±标准差(x̄±s)表示,采用SPSS19.0软件对两组间进行独立样本检验,两组以上数据采用单因素方差分析,剂量与麻醉时间的关系采用Pearson相关性分析,使用GraphPad Prism软件进行做图。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1常规观察

小鼠麻醉前的体质量结果显示各组间无变化差异无统计学意义(P>0.05)见图1。实验组和对照组小鼠腹腔注射后每5min观察一次直至麻醉恢复,对照组无明显异常;三溴乙醇(SXYC)麻醉的低、中、高剂量组均无小鼠死亡:戊巴比妥钠(WB)麻醉的低、中剂量组无小鼠死亡,高剂量组小鼠死亡2只(死亡率为20.0%);舒泰联合盐酸塞拉嗪(SS)麻醉的低、中剂量组无小鼠死亡,高剂量组小鼠死亡2只(死亡率为20.0%)。各组未死亡小鼠在麻醉过程中均匀呼吸且平稳,各组均可达到适宜手术操作的麻醉深度,小鼠完全苏醒后未出现异常反应。

2.2 麻醉时间比较

      SXYC低、中、高剂量组小鼠均麻醉成功(30/30),无小鼠死亡,提示当SXYC麻醉剂量在125~450mg/kg时能安全诱导小鼠麻醉。WB低、中剂量组小鼠均麻醉成功(20/20),无小鼠死亡；高剂量组小鼠麻醉成功(8/10),有2只小鼠死亡;提示当WB麻醉剂量在40-80mg/kg时能安全诱导小鼠麻醉。SS复合麻醉时,低、中剂量组小鼠均麻醉成功(20/20),无小鼠死亡:高剂量组小鼠麻醉成功(8/10)，有2只小鼠死亡;提示当舒泰50(30~60mg/kg)联合盐酸塞拉嗪(6~12mg/kg)复合麻醉时能安全诱导小鼠麻醉。三种麻醉剂随着麻醉剂量的增加，麻醉诱导时间不断缩短,差异具有统计学意义(均P<0.05)(图2A);SXYC、WB、SS 三种麻醉剂相比SXYC低、中、高剂量麻醉诱导时间均较短,分别为1.37、1.04和0.66 min,差异具有统计学意义(均P<0.05)(图2A)。三种麻醉剂随着麻醉剂量的增加麻醉维持时间不断延长,差异具有统计学意义均P<0.05)(图2B):三种麻醉剂相比.SS低中高剂量麻醉维持时间均较长,分别为72.65、272.95和363.89min,差异具有统计学意义(均P<0.05)(图2B)。三种麻醉剂随着麻醉剂量的增加麻醉恢复时间不断延长,差异具有统计学意义(均P<0.05)(图 2C);三种麻醉剂相比,SS 低、中剂量麻醉灰复时间均较短,分别为45.76和60.78min;在高剂量组中，WB高剂量麻醉恢复时间最短为23.85 min,差异具有统计学意义(均P<0.05)(图2C)。三种麻醉剂随着麻醉剂量的增加总麻醉时间不断延长,差异具有统计学意义(均P<0.05)(图2D)。三种麻醉剂相比,SXYC高、中、低剂量组总麻醉时间均较短，分别为96.86、189.94 和471.52min,差异具有统计学意义(均P<0.05):WB低、中剂量组总麻醉时间最长分别为129.97、371.58min;SS高剂量组总麻醉时间最长为517.99 min,差异具有统计学意义(均P<0.05)(2D)。

       随着三种麻醉剂的剂量增加,麻醉维持时间、麻醉恢复时间和总麻醉时间均延长,而麻醉诱导时间缩短。相关性分析结果显示,麻醉维持时间,麻醉恢复时间和总麻醉时间与注射剂量成正比(均P<0.05)(图3 B~D,F~H,J~L):麻醉诱导时间与注射剂量成反比(均P<0.05)(图3A,E,I)。

2.3 对肝、肾功能的影响

与对照组相比,SXYC低剂量组小鼠血清中的ALT AST、GLU、UA无明显改变(均P>0.05)(图4A~D);高剂量组小鼠血清中的ALT、AST都显著升高(均P<0.05)(图4A~B);高剂量组小鼠血清中的GLU 显著下降(P<0.05)(图4C):中、高剂量组小鼠血清中的UA显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)(图4E)。

与对照组相比,WB高、中低剂量组小鼠血清中的AST、GLU、UA均无明显改变(均P>0.05)(图1B~D);高剂量组小鼠血清中的ALT 显著升高(P<0.05),中、低剂量组 ALT 无明显改变(均P>0.05)图 4A)。

与对照组相比.SS低剂量组小鼠的 ALT、AST、GLU、UA指标与对照组相比无明显差异(均P>0.05)(图4A~D):中剂量组小鼠的 ALT、AST、UA指标与对照组相比无明显差异(均P>0.05)(图A~B.D):中剂量组小鼠的GLU显著升高(P<0.05)(图4C):高剂量组小鼠血清中的 ALT、AST、GLU显著升高(均P<0.05)(图4A~C):高、中、低剂量组小鼠血清中的UA无明显改变(P>0.05)(图4D)a

3种麻醉剂相比,高剂量组SXYC与WB 和SS相比,小鼠血清中ALT、AST水平升高更为显著,差异具有统计学意义(均P<0.05)(图4A-B)。中剂量组SS与SXYC和WB相比,小鼠血清中的UA水平升高更为显著,差异具有统计学意义(P<0.05(图4D)。高剂量组SS与SXYC和WB相比,小鼠血清中的GLU和UA水平升高更为显著,差异具有统计学意义(P<0.05)(图4C~D)。

3 讨论

在使用啮齿类动物进行科学研究过程中,不同的麻醉给药方式对麻醉效果影响较大,啮齿类动物的麻醉方式根据给药途径不同分为注射性麻醉和吸入性麻醉。吸入性麻醉剂效果好,比较安全,能更好地控制动物的呼吸状态,但麻醉诱导时需要使用麻醉机和诱导箱等,使操作流程变得繁琐，同时这也增加了经济成本。与吸入性麻醉相比,注射麻醉操作流程简便省时。良好的麻醉剂要求诱导时间短,维持时间适中,恢复时间快,对小鼠各种生理功能影响较小等。使用不同种类的麻醉剂麻醉不同品系的小鼠,其效果截然不同。本实验使用的三种麻醉剂都采用腹腔注射对B6小鼠实施麻醉,实验结果表明三溴乙醇和戊巴比妥钠以合适剂量麻醉对B6鼠麻醉诱导时间均较短,维持时间适中。三溴乙醇高、中、低剂量组和戊巴比妥钠中、低剂量组无死亡，适合于实际的外科手术操作;戊巴比妥钠和舒泰50联合盐酸塞拉嗪的高剂量组的麻醉效果一般,且易造成死亡，不适合于B6小鼠的麻醉。

三溴乙醇是一种非药物级麻醉剂,由于其容易获得、缺乏与其使用相关的地方和国家药物法规以及快速的麻醉诱导和恢复时间,已被广泛用于实验室和兽医实践中多种动物的各种操作^[9]。三溴乙醇在转基因实验室作为小鼠胚胎移植的麻醉剂已有40年的历史,它是一种白色品体粉末,当重复给药时,会产生广泛的中枢神经系统抑制,包括呼吸和心血管中枢的抑制。有研究显示大剂量三溴乙醇具有肝毒性,其在肝代谢过程中与葡萄糖醛酸偶联,然后在尿液中排泄为三溴乙醇葡萄糖醛酸^[10-11]。与单剂量相比,接受两次三溴乙醇麻醉的小鼠的肝质量显著增加^[12]。本研究发现，使用高剂量三溴乙醇麻醉B6小鼠时,小鼠血清中的ALT、AST水平显著升高(图4A~B),这与上述研究结果一致。有研究显示,B6小鼠使用三溴乙醇(200mg/kg)进行麻醉120~180 min 后血糖降低^[13],使用三溴乙醇(250ng/kg)进行麻醉ICR 小鼠时对血糖无影响^[6]。本研究结果表明,在使用高剂量三溴乙醇麻醉12h后血糖显著降低,这与前述研究结果基本一致。本研究使用中和低剂量(125~250mg/kg)三溴乙醇麻醉时麻醉诱导时间、维持时间和恢复时间较合适,对B6小鼠肝,肾功能无影响,推荐125~250 mg/kg为合适剂量范围。

戊巴比妥钠是γ-氨基丁酸亚型A(GABAA)受体的一种氧巴比妥酸盐配体,通过受体通道增加氯离子电导,导致神经元超极化和随后的中枢神经系统抑制,在成功给予致命剂量(150mg/kg)的戊巴比妥钠后,动物会出现共济失调和镇静,之后意识丧夫、呼吸暂停、心脏骤停和死亡^[14]。戊巴比妥钠是一种中效类巴比妥类催眠药,作用时间可维持4~6h,具有起效较快,麻醉效果稳定等优势,一般用作崔眠和麻醉前给药,常用于实验动物的麻醉。研究显示,不同浓度的戊巴比妥钠对不同的实验动物麻效果有所不同。使用3%的戊巴比妥钠1mL/kg对家兔进行麻醉,其麻醉诱导时间为26.43s^[15]。本研究使用1%的戊巴比妥钠40mg/kg来麻醉B6小鼠,麻醉诱导时间为8min。使用1%戊巴比妥钠10ml/kg进行麻醉15 min后,B6 小鼠血糖水平显客升高,麻醉60min后血糖水平恢复正常^[4]。本研究使用戊巴比妥钠麻醉B6小鼠12h后各剂量组血糖无改变,与前述实验结果一致。综合考虑戊巴比妥钠的麻醉剂量,与时间相关的麻醉效果和对B6小鼠肝、肾功能的影响,戊巴比妥钠在40~80 mg/kg时麻醉诱导时间、维持时间和恢复时间较合适，对B6小鼠肝,肾功能无影响,推荐40~80mg/kg为合适剂量范围。

舒泰50(Zoleil®50)是一种新型的专门针对动物设计的注射用麻醉药,由替来他明和唑拉西泮按质量比1:1混合而成的复方麻醉剂。替来他明是一种分离型麻醉剂,其药理作用与氯胺酮类似:唑拉西泮为苯二氮䓬类镇静催眠药,药理作用与安定类似,具有抗焦虑、镇静,抗惊厥和肌肉松弛的作用，唑拉西泮可加强替来他明对中枢神经系统的抑制作用,同时又可防止由替来他明引起的惊厥,增强肌肉松弛效果,还可以缩短麻醉苏醒时间。舒泰50主要用于家养犬、猫和大部分野生动物的保定和全身麻醉,近些年来也被广泛应用于小动物的麻醉。有研究显示单独使用舒泰对小鼠进行麻醉,不能起到很好的麻醉效果^[16]。盐酸塞拉嗪为一种强效α2肾上腺素受体激动剂,具有明显的镇静、镇痛和肌肉松弛作用。研究显示适当剂量的舒泰50联合盐酸塞拉嗪麻醉小鼠能达到很好的麻醉效果且安全,麻醉对B6小鼠血清中的ALT,AST水平无影响。本研究结果显示,当使用舒泰30~60mg/kg(盐酸塞拉嗪6~12 mg/kg)进行麻醉时对 B6 小鼠血清中的 ALT、AST水平无影响^[8],这与前述研究结果一致。本研究结果表明,使用大剂量舒泰麻醉可对肝产生一定影响，这与本实验高剂量组结果一致^[17]。研究显示,舒泰麻醉后血糖含量升高可能是由于麻醉过程中机体基础代谢率降低,间接影响葡萄糖转化,进而导致血糖含量升高^[18]。本实验结果表明,使用中、高剂量舒泰联合盐酸塞拉嗪麻醉后血糖含量升高,与前述结果一致。综合考虑舒泰联合盐酸塞拉嗪的剂量、麻醉时间效果及其对B6小鼠肝,肾功能的影响,在舒泰50联合盐酸塞拉嗪为30~60mg/kg(盐酸塞拉嗪6~12mg/kg)时,麻醉诱导时间、维持时间和恢复时间较合适,对B6小鼠肝,肾功能影响较小,推荐舒泰30~60mg/kg(盐酸塞拉嗪6-12mg/kg)为B6小鼠麻醉的合适剂量范围。

综上所述,按三种麻醉剂的高、中、低剂量梯度给药,B6小鼠的个体差异均较大,对B6小鼠的麻醉效果和血清生化指标的影响也不尽相同。三溴乙醇麻醉 B6 小鼠时,推荐125~250 mg/kg为合适剂量范围;戊巴比妥钠麻醉时,推荐40~80mg/kg为合适剂量范围;舒泰50联合盐酸塞拉嗪麻醉时,推荐舒泰30~60 mg/kg(盐酸塞拉嗪6~12mg/kg)为合适剂量范围。这些数据为今后的科研工作者在使用麻醉剂麻醉啮齿类动物时提供一定的参考依据。

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