不同发育时期小鼠代谢笼实验的最佳适应期探讨

谭 贺, 杨晓辉, 张大秀, 王贵成

(复旦大学发育生物学研究所, 上海 200433)

 [摘要] 目的　探究小鼠代谢笼实验中不同发育时期小鼠的最佳适应时间，以期为利用小鼠开展代谢研究提供参考。方法　使用3个发育阶段（离乳期M1、青春期M2和成年期M3）的雄性C57BL/6J小鼠共80只进行为期7d的代谢笼实验，每5min记录小鼠摄食、饮水、能量消耗、呼吸商、体重和活动水平等数据。通过时间序列分解和综合聚类分析对数据进行处理，采用重复测量方差分析法并结合t检验进行统计学差异比较，以推断最佳适应时间。结果　不同发育阶段的小鼠代谢活动存在明显差异（P<0.01）。与M2和M3小鼠相比，M1小鼠的运动水平较低（P<0.01），并且昼夜节律不明显。M1小鼠具有更高的氧气消耗量、二氧化碳呼出量和能量消耗水平，以及较低的呼吸商（均P<0.001），表明其主要以脂肪作为能量来源。对摄食、饮水和能量消耗等因素进行分析后发现，各发育阶段的小鼠在第1个光周期（0～12 h）与第2个光周期之间（24～36 h）存在明显差异（均P<0.05），而24 h后每日摄食量、饮水量不再有明显差异（均P>0.05）。综合多指标进行聚类分析后发现，小鼠在进入代谢笼的前24 h综合指标与后续6 d的综合指标不成簇，出现离群，表现出明显差异。结论　小鼠代谢笼实验可以用于检测小鼠连续的生理学指标变化，结果   提示小鼠进入代谢笼24 h就可以适应新的代谢笼环境，这为小鼠代谢实验设计提供了理论依据。

[关键词] 代谢笼;适应期;摄食;饮水;聚类分析;小鼠

近年来，代谢性疾病（如高脂血症、高血压病、糖尿病、肥胖、高尿酸血症等）的发病率和死亡率逐年攀升，对人体健康和生命安全造成严重影响，已成为公共卫生领域关注的一个焦点^［1］。此类疾病的发病率随年龄增长而上升^［2］，但其潜在的病理生理机制目前尚未完全阐明，相关概念和标准也尚不明确。因此，了解代谢性疾病的发病机制和早期诊断标准具有重要意义。为探究代谢性疾病的发生风险和致病机制，研究人员常使用小鼠或大鼠代谢异常模型进行实验^［3-5］，其中监测动物代谢与行为指标是评价模型构建成功与否的关键。代谢笼是一种可连续测量和记录实验动物代谢与行为指标的分析系统，广泛应用于研究^［6-8］。代谢笼包含活动、食物、水、氧气和二氧化碳等检测模块，以及数据记录和存储等模块，用以对实验动物进行连续监测^［9］。为确保数据准确，通常在一个笼内只放置一只实验动物。鉴于代谢和行为指标具有周期性特点，代谢笼实验通常持续24 h以上。但是研究发现，单调的独居环境、较小的活动空间和密集分布的金属材料可引发实验小鼠或大鼠出现应激和不适反应^［10-15］。代谢笼中的独居环境会降低大鼠的药物代谢能力^［16］。长时间在代谢笼中饲养的小鼠易出现氧化应激水平、皮质酮水平和肌酐排泄量显著增加的现象。因此，多项实验指南建议缩短小鼠在代谢笼中的时间^［17］。然而，为了获得稳定可靠的后续实验数据，常需要动物适应新环境和位置。因此，代谢笼实验中的适应期设置至关重要。适应期过短可能导致实验数据受环境因素影响；过长则增加时间和经济成本，同时可能影响小鼠的生理和心理状态。另外，适应期受多种因素影响，如实验环境、操作和小鼠特征等，并无固定准则。基于以上考虑，本研究使用不同发育时期的C57BL/6J小鼠进行代谢笼实验前的适应期监测，通过周期性检测确定稳定指标的时间点，以期为同领域研究者提供实验适应期的设计依据，并为其他实验平台提供参考。

1　材料与方法

1.1　实验动物及饲养条件

根据Dutta等^［18］对小鼠年龄的分期标准，选择3个发育阶段的SPF级C57BL/6J小鼠共80只：离乳期 （M1，出生后21～28 d，24只）、青春期（M2，出生后 29～42 d，24只）、成年期（M3，出生后43～70 d，32 只）进行实验研究。实验小鼠来源于美国杰克逊实验室（JAX序列号：1045045），小鼠引进后一直饲养在复旦大学发育生物学研究所的实验动物屏障设施［SYXK（沪）2020-0032］。鉴于雄性小鼠对独居环境具有更强的适应能力^［19］，故本实验选取雄性小鼠作为研究对象。实验动物屏障设施内环境温度为22～ 24 ℃，相对湿度为40%～70%，昼夜光照节律12 h（8∶00～20∶00）。在代谢分析期间使用与小鼠饲养室相同的酸化水、饲料与垫料，以减少小鼠需要适应的环境因素。所有小鼠饲养及实验操作均遵循《复旦大学发育生物学研究所动物管理与使用指南》（2020）的要求，实验方案通过复旦大学发育生物学研究所动物管理委员会批准（No. IDM2021093）。

1.2　实验仪器及其参数设置 

高分辨率多通路小鼠呼吸运动测量系统购自美国 Sable Systems International公司（型号Promethion core）， 实验中使用生活笼、环境监测模块、代谢监测模块、质量监测模块和位置监测模块，1次实验中平行进行8笼检测。实验中小鼠的体重、摄食与饮水情况监测使用通用型MM-1质量测量模块进行，MM-1提供0.002g分辨率的测量结果；笼盒中的代谢相关空气指标由美国Sable Systems International公司的 Promethion 代谢筛查用GA3m2气体分析仪测量，获得二氧化碳、氧气等的含量变化数据；小鼠行为学指标数据由美国Sable Systems International公司的Promethion BXYZ Beambreak 活动监测仪记录，获得小鼠的移动距离和步行距离。 每次实验开始前1 d将实验所需笼具、饲料盒以及气体通道进行高温高压灭菌，水瓶经过紫外消毒室消毒后组装，笼具底部铺一层垫料。在进行气体与模块校准后建立检测文件，水瓶与饲料盒在MM-1测量模块下悬挂过夜，次日检查以防止水瓶泄漏。检测正式开始于次日早上8时，实验小鼠于8∶00左右从饲养室取出，8∶10放入笼具。 

1.3　小鼠运动及代谢数据的采集

80只小鼠进行了为期7 d的代谢笼实验，实验周期内每5 min进行一次实验数据采集，经软件处理后生成csv文件。能量消耗（energy expenditure，EE）与呼吸商（respiratory quotient，RQ）是代谢笼实验中被广泛关注的2个指标，研究中常采用这2个指标的稳定时间作为最短适应时间。能量消耗水平通过检测氧气消耗量（VO2）和二氧化碳呼出量（VCO2），然后根据Weir公式［EE（kcal/d）=（3.9×VO2+1.1×VCO2）×1.44］计算得到。呼吸商代表动物在不同运动强度或生理状态下机体消耗脂肪或碳水化合物的比例，其通过生成二氧化碳和消耗氧气的比率（RQ=VCO2/VO2）计算得到。X、Y、Z轴移动频率和步行距离可反映小鼠探索新事物的天性，这2个指标的稳定时间象征着探索期结束时间。总运动距离反映小鼠在代谢笼环境中的整体运动强度。食物摄入、饮水与体重是反映小鼠适应期效果的3个指标，当这3个指标稳定时，认为小鼠已经适应新环境^［20］。在本研究中，选择能量消耗、呼吸商、体重、食物摄取、饮水和活动水平等作为小鼠对环境适应程度的指标。以24 h为周期，对数据进行时间序列分解和综合聚类分析，以判断小鼠的适应时间。

1.4　统计学方法

使用SPSS 26.0软件进行各指标数据的统计分析，然后采用Python 3.12.2软件进行数据可视化处理和统筹分析。结果数据以平均值±标准误（x̄±se）表示，采用重复测量方差分析3个发育阶段统计数据的差异显著性，并采用双侧t检验进行组内前后两天指标的比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1　小鼠的运动水平与年龄相关

小鼠进入新环境后通常会经历几个不同的适应阶段：第一阶段是畏惧期，此阶段小鼠刚进入新环境，通常会在角落蜷缩身体，判断环境是否有威胁存在；第二阶段是探索期，此阶段小鼠多数会沿边界运动并探索周围环境；第三阶段为适应期，此阶段小鼠基本可以适应当前环境，不再恐惧并且恢复正常的进食、饮水和打理毛发等行为。在实验过程中，剔除部分小鼠状态恶化或中途死亡、代谢笼盒传感器故障和水瓶泄漏等数据后，共有48只小鼠（M1即离乳期8只，M2即青春期16只，M3即成年期24只）的活动和代谢数据纳入统计。对于纳入统计的小鼠，统计其在代谢笼中对X、Y、Z轴红外射线矩阵的打断次数（反映移动频率）。结果显示，M1小鼠在X、Z轴上移动频次显著低于M2小鼠（P<0.01，P<0.001） 和 M3 小鼠 （P<0.01，P<0.001）（图1A～C）。统计各个发育时期的小鼠在代谢笼中每5min的运动距离，结果显示，M1小鼠在每5 min内的运动距离显著短于M2小鼠（P<0.01）和M3小鼠（P< 0.05），并且呈现出较差的昼夜节律（图1D～F）。以上结果提示，小鼠的运动水平与其发育阶段密切相关。

2.2　小鼠的代谢能力与年龄相关

随着年龄增长，小鼠在代谢笼中的氧气消耗量（4.586±0.247 7、4.020±0.277、3.602±0.168 6） 和二氧化碳呼出量（3.489±0.199 2、3.109±0.164 0、2.984± 0.205 8）逐渐降低，离乳期（M1）小鼠的氧气消耗量和二氧化碳呼出量显著高于青春期（M2）和成年期（M3）小鼠（均P<0.001，图2A～B）。通过Weir公式计算得到的能量消耗水平也同样逐渐降低（0.527±0.005 1、0.460±0.002 9、0.420±0.001 9），M1小鼠显著高于M2和M3小鼠（均P<0.001，图2C）。不同发育阶段小鼠的呼吸商存在差异，M3小鼠明显高于M2和M3小鼠（均P<0.001，图2D）。尽管成年期小鼠的呼吸商仍然较低，表明脂肪是主要的能量来源，但随着年龄增长，能量来源从以脂肪高占比向以碳水化合物高占比转化。以上结果提示，小鼠的代谢能力随着年龄发生变化。

2.3　小鼠适应能力随时间变化

对小鼠各项适应能力数据进行整理分析，第1天（0～24 h时间段）和第2天（24～48 h时间段）的饮食数据比对后发现，小鼠的摄食量和饮水量没有显著差异（P＞0.05）；同样，第2天（24～48 h时间段）和第3天（48～72 h时间段）的摄食量和饮水量也没有显著差异（P＞0.05）。结果表明，在24 h时间内，小鼠已经可以正常进食和饮水，并在后续实验周期内趋于稳定（表1）。3个发育时期的小鼠在X、Y、Z轴上的运动水平随时间变化（图1A～C）。进一步对小鼠在X、Y、Z轴上运动打断射线的频次总和进行比对分析后发现，M2和M3小鼠在第1天的运动水平显著高于第2天及后续实验周期（均P<0.001，表1）。结果说明代谢笼实验第1天时小鼠处于探索代谢笼环境的适应阶段；小鼠在第2天及后续实验周期内各个方向上的运动水平稳定，说明此阶段小鼠已对代谢笼环境有了很好的适应能力。为了精确探究小鼠对新环境的适应时间，对前2 d的情况进行了详细研究，特别是比较了第1个光周期 （0～12 h）和第2个光周期（24～36 h）内小鼠的摄食量和饮水量变化。结果显示，M1小鼠在第1个光周期与第2个光周期之间的摄食量和饮水量都存在显著差异（P<0.05，P<0.001），M2小鼠的摄食量和饮水量差异不明显，M3小鼠仅摄食量有显著差异（P<0.001，表2）。结果说明，不同年龄小鼠适应摄食和饮水的时间略有不同，但24 h内都会趋于稳定。在3个不同发育阶段的小鼠中，M1、M2小鼠的氧气消耗量、二氧化碳呼出量和能量消耗水平在第1天和第2天之间无显著差异（均P>0.05），但M3小鼠的氧气消耗量、二氧化碳呼出量和能量消耗水平在第1天和第2天之间存在显著差异（均P<0.05，图2）。基于上述多项指标的综合考量可知，3个发育阶段的小鼠在进入新环境的24 h内已经成功适应。 

2.4　代谢笼环境中小鼠适应时间的可视化处理 

为了更加直观地分析3个发育阶段小鼠的代谢指标变化，运用Python软件对收集到的小鼠代谢笼数据进行分析。选取每5 min内所有定向运动距离总和、在XYZ轴上的移动频次、氧气消耗量、二氧化碳呼出量、摄食量和饮水量等指标进行可视化处理。结果显示，每5 min内所有定向运动总和以及X、Y、Z轴上的移动频次这4个运动指标在第1天都显著高于后续周期。同样地，第1天的氧气消耗量、二氧化碳呼出量和摄食量指标数据出现了偏高的离散曲线，后续阶段的数据趋于稳定且与小鼠在光周期与暗周期的活动和生理状态相吻合，呈现在光周期内活动水平和氧气消耗水平低，暗周期内活动水平和氧气消耗水平高的特点（图3）。

2.5　代谢笼环境中小鼠适应时间的聚类分析

运用Python软件的K-means算法对氧气消耗量、二氧化碳呼出量、呼出水含量、能量消耗、呼吸商、每5 min内所有定向运动总和、总运动距离、摄食量和饮水量指标进行聚类分析。分析结果显示，M1小鼠的第1天数据（M1_1）与后续6d的数据（M1_2～M1_7）相分离，不能形成聚类；M2和M3小鼠同样呈现了第1天与后续6d数据离散的结果，不能形成聚类（图4）。综上所述，各个发育时期的C57BL/6小鼠在进入代谢笼环境后，仅需24h便能适应环境，随后可开始收集代谢数据。

3　讨论

本研究使用的Promethion系统采用流式呼吸测量法检测代谢率，使用各种传感器技术监测食物和水的摄入量、动物体重和运动位置（X、Y、Z红外探测阵列），同时配备环境监测、跑轮、通道等模块应用于特殊的实验设计。为了保持实验的普适性，本研究仅使用了生活笼、环境监测、代谢监测、体重监测和位置监测模块。成功设置后，该系统在指定时间范围内每5 min进行一次代谢、体重和位置数据的测量，同时监测环境变量，如光照、温度、湿度和声音等。然而，由于实验平台的差异，包括饲养室与实验室、代谢笼与饲养笼之间的差异，如环境噪声、温度、光照等，会导致小鼠产生探索和适应的行为。这些行为可能会影响小鼠的日常行为模式和日夜节律，从而使得特定时段的数据无法完全代表正常状态下的小鼠行为和代谢表型。 先前的研究普遍认为，正常小鼠在代谢笼实验中 的适应时间应该大于48 h，从48 h开始，数据基本能达到稳定状态^［20-21］。然而，由于研究的具体内容不同，实验者通常使用不同年龄和品系的小鼠进行代谢笼实验。因此，年龄和品系应是影响小鼠最佳适应时间的两个主要因素。 本次研究采用摄食、饮水、体重和活动水平作为衡量小鼠适应代谢笼环境的指标。通过连续7 d的数据采集分析发现，不同发育阶段的小鼠代谢水平存在显著差异。离乳期（M1）小鼠在X、Z轴上打断红外射线的频次和每5 min运动距离均显著低于青春期（M2）和成年期（M3）小鼠。这表明M1小鼠的运动频率较低，运动距离较短。此外，M1小鼠在食物摄入、饮水和运动方面的节律性较差，在光周期和暗周期阶段没有明显区别。因此，在进行代谢检测，特别是易受生物节律影响的生理数据时，应谨慎考虑使用M1或日龄更小的小鼠。M2和M3小鼠在进入代谢笼的第1天呈现活动频率高、运动量大，并伴随氧气消耗量、二氧化碳呼出量和能量消耗提高的现象；然而，与第2天和后续阶段相比，第1天的摄食量、饮水量、体重和能量消耗水平均显著降低，这可能是由于适应新环境所致。不过，第2天相较于第3天以及随后的时间，这些数据之间没有显著差异。说明在经过1 d适应后，小鼠已经在新的代谢笼环境中取得良好的适应效果。早期研究中，对代谢笼适应期的设置问题往往存在不同的观点。Kalliokoski等^［17］利用BALB/c小鼠进行了为期3周的代谢笼实验，结果显示代谢笼实验组小鼠的代谢物皮质酮和肌酐水平显著升高，机体处于较高的氧化应激水平，因此认为小鼠无法适应代谢笼环境。Eriksson等^［22］研究表明，对于年幼大鼠，代谢笼环境不会造成明显的应激反应。另有研究表明，小鼠的饲养、攀爬、梳理毛发、进食行为和皮质酮水平在饲养位置改变后立即发生显著变化，但大多数行为会相对较快地稳定下来，皮质酮水平会在1 d内恢复到正常水平^［23］。已知新的饲养环境会影响小鼠生理和心理状态，而长时间的代谢笼环境被认为对于小鼠是一种中度或重度压迫^［24］。另一方面，为了得到稳定可靠的数据，应该让动物适应新的笼子和位置的变化［23］。因此，在小鼠代谢检测实验中，适应期的设计是必要且关键的。根据小鼠的年龄和品系设计代谢笼实验的适应期，是提高实验效率和数据可用性的有效手段。本研究结果显示，对C57BL/6小鼠进行代谢活动检测时，设置24 h的适应期是比较合适的选择。鉴于代谢检测系统的多样性和动物平台的差异，本研究结果还有待于进一步验证，不能否定其他的代谢检测系统或平台存在不同于本平台的研究结果。本研究可为使用Promethion系统的代谢笼实验提供数据支持，同时也可为其他平台的代谢笼实验设计提供参考。

[医学伦理声明]

本研究涉及的所有动物实验均已通过复旦大学发育生物学研究所动物管理与使用委员会审核批准（No. IDM2021093）。所有动物实验过程均遵循中国实验动物相关法律法规条例如《实验动物管理条例》和《复旦大学发育生物学研究所实验动物管理和使用指南》（2020版）等要求进行。

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