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小鼠卵母细胞的提取和显微注射
来源:透明乘客 xiaLab微信公众号 | 作者:管理员 | 发布时间: 2018-02-11 | 9134 次浏览 | 分享到:
染色体分离的错误导致非整倍体细胞形成。在体细胞中,非整倍体与癌症有关,但在配子中,非整倍体导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。卵母细胞(oocyte)是在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞,它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂( MI )和第二次减数分裂的产物( MII )。在哺乳动物中,卵母细胞完成MI并经历不对称细胞分裂,在MII中期停止。卵子只有通过精子受精才能完成MII。分离前期阻滞卵母细胞和显微注射的方法进行卵母细胞体外培养,为快速获得转基因和基因敲除等小鼠提供条件.

染色体分离的错误导致非整倍体细胞形成。在体细胞中,非整倍体与癌症有关,但在配子中,非整倍体导致不孕、流产或唐氏综合征等发育障碍。卵母细胞(oocyte)是在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞,它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂( MI )和第二次减数分裂的产物( MII )在哺乳动物中,卵母细胞完成MI并经历不对称细胞分裂,在MII中期停止。卵子只有通过精子受精才能完成MII。分离前期阻滞卵母细胞和显微注射的方法进行卵母细胞体外培养,为快速获得转基因和基因敲除等小鼠提供条件.



小鼠卵母细胞的提取

1.为了最大化从每只小鼠分离的窦卵泡的数量,腹膜内注射5IU妊娠母马血清促性腺激素(pregnant mare's serum gonadotropinPMSG )促性成熟

2 .,制备37℃卵泡收集液( MEM /PVP+M ) ( 3 ml /小鼠),含milrinone(磷酸二酯酶抑制剂)2.5 μM,一旦从取出卵母细胞,就能维持减数分裂停止。

3 .PMSG注射约48h,用安乐死小鼠,取出卵巢,将它们放入含有预加热的卵泡收集液的可观察的玻璃皿中。

4 .使用1 ml胰岛素注射器,将卵巢固定在培养皿上。

5 .当通过解剖显微镜观察时,使用玻璃吸管收集卵丘和卵母细胞复合体。卵丘(cumulus oophorus)是随着卵泡液增多,卵泡腔扩大,初级卵母细胞、 透明带、 放射冠及部分卵泡细胞突入卵泡腔内。只收集大的有腔卵泡,而不收集小的有无腔卵泡或和卵丘脱离的卵母细胞。

6 .用一个小吸管(略大于卵母细胞的直径),反复吹吸复合体以分离卵丘细胞。用较大的移液管将剥离的卵母细胞转移到培养基(CZB  medium)中并置于培养箱中。

7 .卵母细胞注射前在培养箱中恢复至少1小时。


卵母细胞显微注射

1 .通过玻璃毛细管制作进样移液器。拉针仪(型号P - 97 )具有以下设置: P =500,热量= 300,拉力= 150Vel = 100,时间= 150

2 . 5μlMEM / PVP +M液滴制备微注射平台,准备的0.5μl注射液滴(例如siRNAcRNA)

3 .将进样和吸液管放入注射支架中,并放入MEM/ PVP + m液滴中。在加注移液器时,轻轻轻敲进样移液器的吸头,适当开口。如果开口太大,介质将快速进出,针头将杀死细胞。太小的移液器开口易堵塞。

4 .将卵母细胞( 5 - 10 )从培养箱转移到平台上的MEM/ PVP + M液滴中。

3s。注射体积为5 - 10pl的。本实验注射设备来自哈佛设备的PLI - 100型,参数如下: PBal = 2.5 - 3.5 psiPInj = 7.8 psiPClear = 10 - 12 psi,时间=3秒。

6 .使用固定吸液管吸住卵母细胞并沿x轴对齐注射针、卵母细胞和固定吸液管。

7 .在较高放大倍数下,将注射吸液管推进卵母细胞,小心避开细胞核。一旦质膜被刺穿,按下注射键。注射完毕,拔针。一旦所有的卵母细胞被注射,放回培养箱。

卵细胞的形成过程图解(来源于网络)

卵巢取材


提取的卵母细胞

卵母细胞显微注射平台

卵母细胞注射

卵母细胞收集和注射时使用的抑制卵母细胞分离的液体((MEM / PVP+M ) )

培养基配方(CZB medium

参考文献

Stein, P., Schindler, K. Mouse Oocyte Microinjection, Maturation andPloidy Assessment. J. Vis. Exp. (53), e2851, doi:10.3791/2851 (2011).

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